现代农业科技圆园18年第19期园艺学马铃薯试管苗病毒检测技术研究梁杰1李功义2渊1大兴安岭农林科学院袁黑龙江加格达奇165000曰2大兴安岭农工商联合公司冤摘要根据大兴安岭马铃薯种薯生产实际袁应用酶联免疫吸附检测法渊ELISA冤检测茎尖组织培养试管苗的带毒情况袁鉴定危害马铃薯生产的6种主要病毒渊PVX尧PVY尧PVS尧PVM尧PVA尧PLRV冤袁并结合指示植物如千日红进行最后鉴定袁筛选健康尧无毒的试管苗袁为切段扩繁及试管薯生产作准备遥该方法简单易操作袁可作为国内生产脱毒种薯单位的标准检测方法进行推广遥关键词马铃薯试管苗曰病毒检测曰酶联免疫吸附检测法曰指示植物接种鉴定法中图分类号S532文献标识码A文章编号1007-5739渊2018冤19-0081-01在生产上袁马铃薯以无性繁殖为主袁种植过程中容易感染病毒袁并通过块茎世代传递袁导致病害逐年加重尧马铃薯产量和品质下降[1]遥由于脱毒苗有再侵染的可能袁对基本无毒核心苗进行连续跟踪检测[2-3]袁以保证试管苗质量遥对黑龙江省主栽马铃薯品种脱毒试管苗按株系进行检测筛选袁采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳方法渊R-PAGE冤袁检测主栽品种脱毒试管苗带类病毒状况袁筛选出无类病毒的试管苗株系遥1材料与方法1.1试验材料马铃薯试管苗材料来源于黑龙江省大兴安岭地区农林科学院组培室袁以东农303尧早大白尧费乌瑞它尧尤金尧中薯一号尧大西洋尧郑薯6号尧克新13号尧诺兰尧中薯3号尧中大一号马铃薯试管苗作为检测样品曰马铃薯病毒检测试剂盒购于瑞士袁由苏庆祥渊博士冤代购遥1.2仪器和设备聚苯烯微量滴定板渊96孔冤尧酶联检测仪尧微量可调进样器渊0.5~10.0滋L尧10.0~40.0滋L尧40.0~200.0滋L3个规格冤及相应规格的塑料头尧电光天平渊精确到0.1mg冤尧冰箱尧培养箱渊温度定为37益冤尧瓷研钵遥1.3试剂及配制方法试剂为分析纯袁用水为蒸馏水遥抗体免疫球蛋白渊r-globulin冤和酶标抗体渊Coniugate冤院从某一马铃薯病毒抗血清提取的免疫球蛋白袁用辣根过氧化物酶标记的某一病毒的免疫球蛋白的酶标记抗体袁一般使用浓度常在1颐1000以上遥贮藏于4益条件下备用遥1.59g碳酸盐包被缓冲液与碳酸氢钠渊NaHCO院pH值9.6袁取无水碳酸钠渊Na23冤2.93g袁定溶于1L蒸馏水中CO遥3冤配制方法为氯化钠PBS-Tween20缓冲液渊NaCl冤院8pHg尧磷酸二氢钾值7.4袁用于洗涤微量滴定板渊KH2PO4冤0.2g尧七遥水合磷酸氢二钠渊Na2钠渊NaHPO4窑7H2O冤2.2g[或十二水合磷酸氢二渊NaN23冤HPO0.2g4窑12H袁加水至2O冤12.9L袁然后加g]尧氯化0.5钾mL渊KClTween-20冤0.2g尧遥迭氮化钠样品缓冲液为PBS-Tween20+2%PVP渊聚乙烯吡咯烷酮0.1冤遥加邻苯二胺mol/L底物缓冲液柠檬酸溶液院0.2mol/L40mg尧30%H24.32OmL+Na22渊过氧化氢水HPO504窑mL12H冤0.15袁pH2O溶液25.7mL+mL值袁5.0混匀袁临用前袁避光放置袁应为白色或微黄色溶液遥作者简介梁杰渊1973-冤袁女袁河北沧州人袁高级农艺师袁从事马铃薯组织培养尧马铃薯脱毒技术研究与开发及推广应用工作遥收稿日期2018-05-31终止液院碱性磷酸酯酶用3mol/LNaOH中止袁辣根过氧化物酶用2mol/LH试验设计2SO4终止遥1.42渊1冤酶联免疫吸附检测法遥设定2个阴性对照A1尧B1袁郑薯个阳性对照6号尧费乌瑞它C1尧D1袁尧2尤金个空白尧中薯一号E1尧F1遥尧取东农大西洋尧303克新尧早大白13号尧尧诺兰尧中薯3号尧中大一号马铃薯试管苗袁每个品种取8支试管苗进行检测6号尧7号尧8号尧9袁分别标记为号1号尧2号尧3号尧4号尧5号尧11号尧1号试管苗第8尧支记为10号尧1118号号袁袁1以此类推号试管苗第遥1支记为渊2冤指示植物接种鉴定法遥取各参试马铃薯品种试管苗汁液作为检测样品袁接种于千日红叶片袁检测6种主要病毒渊PVX尧PVY尧PVS尧PVM尧PVA尧PLRV冤遥1.5操作方法1.5.1酶联免疫吸附检测法遥1颐1000渊1冤稀释包被微量滴定板袁用微量进样器向微量滴定板的每一样品孔内遥将免疫球蛋白用包被缓冲液按加入稀释的免疫球蛋白200滋L袁在37益条件下孵育4h或在4益条件下过夜遥渊2冤洗涤包被的微量滴定板遥甩掉微量滴定板中的免疫球蛋白稀释液袁再在一叠吸水纸上敲打微量滴定板遥向微量滴定板的样品孔中加满洗涤液袁停留3min袁甩掉洗涤缓冲液袁共洗涤3次袁以除尽未被吸附的免疫球蛋白遥渊3冤加被检测的样品遥在无菌条件下袁从试管苗上剪下长2cm茎段袁放在小研钵内袁将取样后的试管苗放回试管中并封口袁对样品编号袁以便根据检测结果取舍遥向小研钵中加样品缓冲液袁加入的量根据上样孔数而定袁研磨遥每孔加1个200尧渊空白对照滋L检测样品4冤显色遥洗板后1个袁袁37每袁加入用样品缓冲液益1孵育块微量滴定板上可设置阳性对照4h或4益条件下过夜1颐1000稀释的酶遥标记抗体100滋L袁每孔加渊5袁冤当一些样品孔间显现不同颜色时200滋L曰再洗板袁然后加入底物缓冲液读取结果遥一是目测观察遥显现颜色深浅与病毒相袁加入50mL终止液遥对浓度成正比遥显现白色为阴性反应袁记录为野-冶曰显现淡橘红色为阳性反应袁记录为野+冶袁依色泽逐渐加深记录为野++冶和野+++冶遥二是用酶联检测仪测定光密度值遥样品孔的光密度值大于阴性对照光密度值的2倍袁即确定为阳性反应渊阴性对照孔的光密度值应臆0.1冤遥渊下转第83页冤81李小刚等院连城保护区羊肚菌人工栽培技术研究2结果与分析试验结果表明袁用纯草木灰的栽培料对菌棒进行拌种是比较适宜羊肚菌的栽培基质曰在菌种播种后袁保持一定的湿度和温度极为重要曰在菌丝生长阶段袁不能受到太阳曝晒或者直晒遥纯草木灰栽培料较煤灰和草木灰混合物栽培料的出菇率高46%左右袁且纯草木灰栽培每窝羊肚菌数量较煤灰和草木灰的混合物栽培高遥3结论与讨论在菌种播种后保持一定的湿度和温度十分重要袁而且菌丝生长阶段不能受到太阳曝晒或者直晒遥本试验结果表明袁用纯草木灰作栽培料对菌棒进行拌种较适宜羊肚菌栽培遥栽培方法是在室外选择多阴少阳尧土质疏松潮湿尧排水良好的地方袁挖栽培坑袁坑深20~25cm曰栽培前先用水浇湿坑底袁将栽培料用水拌匀尧铺于坑底袁压平后的厚度为4~5cm曰菌种用量为2袋/m袁菌袋规格为12cm伊28cm袁将菌种2因此袁人工栽培时间应尽量选择11要12月遥羊肚菌生长发育期忌阳光直射遥微弱的散射光有利于羊肚菌子实体的生长发育袁阳光强烈尧直射时则生育不良遥羊肚菌常生长在石灰岩或白垩土壤中袁在腐殖土及黑色壤土尧黄色壤土尧砂质混合土中也能生长遥中性或微碱性土壤有利于其生长袁因而栽培时要求土壤pH值为6.5~7.5[4]遥足够的氧气对羊肚菌的正常生长发育必不可少遥羊肚菌在暗处及过厚的落叶层中很少发生袁即使发生质量也较差遥羊肚菌是喜湿菌类袁整个生长期保持湿度很重要遥在室外栽培袁尤其是早春袁雨水较多袁湿度较大袁温度合适袁有利于羊肚菌生长发育袁其菌丝体和子实体生长良好尧菌核易形成曰如遇干旱袁应适时浇水保湿[5]遥早春有连续几周4~16益的温度袁能刺激羊肚菌子实体的形成曰如果温度变化剧烈袁如低于4益或高于16益则会影响子实体的形成及发育遥因此袁应创造适宜菌核形成及子实体生长发育的良好条件袁在早春保持一定温度及适宜的湿度[6]遥[1]张洪路袁张华东.名贵羊肚菌栽培更讲究[J].农村新技术袁2010渊23冤院12-13.[2]丁湖广.名贵珍稀羊肚菌生物特性及栽培新技术[J].科学种养袁2016渊6冤院27-28.[3]陈影袁唐杰袁彭卫红袁等.四川羊肚菌高效栽培模式与技术[J].食药用菌袁2016袁24渊3冤院151-154.[4]陈大春.羊肚菌对生态条件的要求和关键栽培技术[J].农业与技术袁2015袁35渊6冤院6.[5]黄忠乾袁唐利民袁邓玲袁等.林下羊肚菌高效栽培技术[J].四川农业科技袁2018渊1冤院24-25.[6]杨海平.舟曲县羊肚菌人工栽培技术初探[J].农业科技与信息袁2016渊11冤院76.掰成核桃大小的菌块袁均匀撒在料上袁然后用薄层细腐殖土覆盖曰然后在菌种上铺第2层料袁厚度仍为4~5cm袁压平后再播菌种袁方法同上遥播完后用疏松腐殖土覆盖袁厚度为3~5cm袁其上再盖一层阔叶树叶袁以起到保温保湿的作用遥覆盖射袁可以在树叶上搭盖树枝遥羊肚菌属低温高湿型真菌袁羊肚菌生长期长袁除需较低气温外袁还要较大温差袁以刺激菌丝体分化遥野生羊肚菌多于3要5月雨后发生曰8要9月也偶有发生袁但数量很少遥羊肚菌菌丝生长适宜湿度为65%~85%袁温度为21~24益曰首核形成温度为16~21益袁子实体形成与发育温度为4.4~16.0益遥渊上接第81页冤1.5.2后袁在树叶上适当洒些水遥另外袁为防止人畜践踏和强光直4参考文献合指示植物鉴定筛选脱毒基础苗袁方法简单易操作袁可作为国内生产脱毒种薯单位的标准检测方法进行推广遥采用酶联免疫吸附技术袁从瑞士引进马铃薯病毒检测试剂盒渊PVX尧PVY尧PVS尧PLRV冤袁应用Coda全自动酶免系统袁除人工包板尧研样外袁加样尧洗板尧加酶标尧洗板尧加底物尧孵育尧洗板等一系列工作都在计算机操纵下进行袁一次能检测3块板270个样品袁减少了工作环境和人为误差袁大大提高了检测质量尧速度尧数量袁实现了大规模种薯检验袁保证了脱毒种薯质量[4-5]遥指示植物接种鉴定法较常使用袁主要根据病毒在指示植物上的症状袁但要花费较多时间袁一般为6~7d遥此外袁在寄主上的症状表现还受环境渊如温度尧光强度等冤影响袁会阻碍指示植物鉴定法快速对病毒病的预测袁一般只作为定性检测手段[6]遥[1]吴凌娟袁张雅奎袁温福君袁等.马铃薯茎尖脱毒技术在大兴安岭种薯生产上的应用[J].中国马铃薯袁1998渊3冤院35-37.[2]蒋先林袁杨鲁生袁丁云双袁等.低纬高原马铃薯脱毒种薯标准化生产技术[J].安徽农业科学袁2013袁41渊35冤院13506-13509.[3]左晓斌袁邹积田.脱毒马铃薯良种繁育与栽培技术[M].北京院科学普及出版社袁2012.[4]郭志乾袁吴林科袁赵永峰.马铃薯优良品种及配套栽培技术[M].银川院宁夏人民出版社袁2009.[5]刘在东.马铃薯Y病毒分子检测试剂盒的研制及株系普查[D].沈阳院东北农业大学袁2008.[6]张丽珍袁董家红袁郑宽瑜袁等.云南省马铃薯脱毒试管苗和微型薯病毒检测与分析[J].中国马铃薯袁2015袁29渊1冤院42-45.指示植物接种鉴定法遥2017年3月10日袁用磷酸缓冲液提取试管苗汁液袁用600目金钢砂均匀喷洒在叶子表面袁用脱脂棉做成小棉棒袁用镊子夹着蘸取汁液摩擦接种在千日红渊Gomphrenaglobosal冤离体叶片上袁及时用清水冲掉接种叶片上的杂物遥6~7d后袁逐日观察症状反应遥没有表现出明显病毒症状袁说明脱毒基础苗病毒含量低或没有遥2结果与分析2.1酶联免疫吸附检测法检测样品提取液注入凹槽为200滋L袁酶联免疫吸附检测法渊ELISA冤鉴定PVX病毒袁只有含PVX浓度较高袁超过对照阳性样品含量袁才视为含PVX遥由病毒颜色反应可以看出袁1号渊A2-H2冤尧2号渊A3-H3冤尧3号渊A4-H4冤尧4号渊A5-H9冤尧9号渊A10-H10冤尧10号渊A11-H11冤尧11号渊A12-H12冤马铃薯样品均不含PVX遥田间未发现其他几种病毒表现出症状袁故未检测遥2.2指示植物接种鉴定法千日红为鉴定PVX的最有效指示植物遥试验结果表明袁接种叶片上有明显紫红色环状枯斑症状袁说明大西洋试管苗含马铃薯X病毒渊PVX冤遥3结论与讨论试验结果表明袁用酶联免疫吸附技术渊DAS-ELISA冤结H5冤尧5号渊A6-H6冤尧6号渊A7-H7冤尧7号渊A8-H8冤尧8号渊A9-4参考文献83
