(19)中华人民共和国国家知识产权局
*CN103430852A*
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103430852 A(43)申请公布日 2013.12.11
(12)发明专利申请
(21)申请号 201310412811.8(22)申请日 2013.09.12
(71)申请人南京泽朗农业发展有限公司
地址211225 江苏省南京市溧水县白马镇工
业集中区食品园3号(72)发明人苏刘花(51)Int.Cl.
A01H 4/00(2006.01)
权利要求书1页 说明书3页权利要求书1页 说明书3页
(54)发明名称
一种铁皮石斛悬浮细胞多糖含量增加的方法(57)摘要
本发明研究了一种铁皮石斛悬浮细胞多糖含量增加的方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养、稀土铁皮石斛试管苗多糖的含量等步骤，本发明方法所制备的铁皮石斛悬浮细胞生长好，代谢物质多糖的含量高。本发明方法利用稀土对铁皮石斛悬浮细胞进行有目的的，可以在短期内获得大量多糖含量高的铁皮石斛细胞，获得大量的制药原料，并能有效降低生产成本，益于进行工业化生产。
CN 103430852 ACN 103430852 A
权 利 要 求 书
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1.一种铁皮石斛悬浮细胞多糖含量增加的方法，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：野外生长的铁皮石斛叶片，在MS培养基上，附加激素NAA 1mg/L，IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，诱导愈伤组织，诱导30天，继代4-5次，继代周期20天，取继代后的嫩绿松散的愈伤组织，加入White液体培养基中，附加激素TDZ0.1-0.5mg/l+IAA0.3-1.0mg/l，进行铁皮石斛悬浮细胞培养，培养30天后，在培养基中加入1-3mg/l稀土，进行悬浮细胞和多糖含量的，取样后采用水提法提取铁皮石斛多糖含量，提取时间为7.5 h，料液比为1:20，pH为8.5，使用树脂吸附法对多糖进行纯化，D301R树脂对铁皮石斛多糖吸附量大，氯化钠洗脱效果最好，使用苯酚-硫酸法对纯化后的多糖进行检测。
2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：所述无菌的石斛外植体叶片和芽按照下述方法得到：取野生铁皮石斛叶片和芽，洗衣粉浸泡3分钟，流水冲洗1-2小时，经酒精消毒处理30s，氯化汞消毒处理8分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分。
3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：培养条件温度25℃，湿度70%，光照2000-4000lx，光期14h。
4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：铁皮石斛悬浮细胞的培养选择的培养基为White培养基，附加激素TDZ和IAA。
5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：铁皮石斛多糖的的稀土优选为镧。
6.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：在培养基中加入的稀土为过滤灭菌。7.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：本发明采用水提法提取，精密度RSD%为3.12%，重现性RSD%值为1.83%，稳定性RSD%值为3.8%。
8.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：本发明采用D301R树脂对多糖进行纯化，吸附液25℃，浓度5mg·mL－1，pH为7.0，吸附流度为1.8mL·min－1时吸附较强。
9.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：本发明采用氯化钠进行洗脱，最佳洗脱浓度0.5mol·L－1，洗脱率达.72%。
10.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：本发明采用苯酚-硫酸法对铁皮石斛多糖进行检测，以葡萄糖标准液绘制标准曲线，加入1.5mL5%的苯酚溶液，硫酸5mL，显色温度80℃，在水浴中加热30min，在波长488nm下测定铁皮石斛多糖的含量，此种方法快速、显色稳定、重现性好、适用于铁皮石斛多糖含量的测定。
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CN 103430852 A
说 明 书
一种铁皮石斛悬浮细胞多糖含量增加的方法
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技术领域
[0001]
本发明涉及稀土铁皮石斛悬浮细胞多糖含量增加的方法。
背景技术
铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是兰科石斛属多年生附生草
本植物，主要分布于西南和江南各省，为我国传统常用中药，石斛的药用部分是茎，具有益胃生津、滋阴清热的功效。由于种子极小、无胚乳，自然繁殖率低，很难用实生苗栽培；而传统的分株、扦插等方式的繁殖率亦极低，近些年来，人为的过度采挖和破坏其适生环境，其资源已濒临灭绝，是资源最为缺乏的一种，在19年被国家列为重点保护的药用植物之一。铁皮石斛主要有效成分为石斛类多糖及生物碱，另外还有酚类、菲类、芪类、倍半萜类及香豆素等，其主要药效成分为多糖，且含量较高，现代药理研究报导石斛多糖具有抗肿瘤、增强免疫力、降低血糖等作用。
[0003] 镧是17种稀土元素中最重要和最活泼的元素，适当浓度La3+对幼苗的生长起积极作用，研究表明La3+与Ca2+的半径相似，化学性质上可能存在着竞争作用。La3+和Ca2+的作用相似，能够取代Ca2+在细胞膜上的位置，并在一定的条件下产生与Ca2+相似的作用。可以提高蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性，可以作为植物光合作用的催化剂，促进植株的生长，提高幼苗干重。近年来的研究发现稀土亦具有抗寒、抗旱等抗胁迫的能力，试验证明稀土元素能促进植物细胞培养中次级代谢产物的积累，镧、铈对东北红豆杉悬浮细胞中紫杉醇合成与释放具有一定作用，稀土离子可以通过不同方式与酶结合，从而影响酶的活性。稀土元素能提高植物细胞中次级代谢产物的含量可能与它们影响多种酶的活性有关。
[0002]
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供铁皮石斛悬浮培养的快速繁殖方法，并通过稀土对其进行获得生长良好，多糖含量高的细胞，进行工业大规模生产，可以规模化的为药厂提供铁皮石斛多糖的来源。[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案：
野外生长的铁皮石斛叶片，在MS培养基上，附加激素NAA 1mg/L，IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，诱导愈伤组织，诱导30天，继代4-5次，继代周期20天，取继代后的嫩绿松散的愈伤组织，加入White+TDZ1mg/l+IAA0.5mg/l，进行悬浮细胞培养，继代3次后，在培养基中加入2mg/l稀土，进行细胞多糖含量的，取样后采用水提法提取铁皮石斛多糖含量，提取时间为7.5 h，料液比为1：20，pH为8.5，使用树脂吸附法对多糖进行纯化。D301R树脂对铁皮石斛多糖吸附量大，氯化钠洗脱效果最好，使用苯酚-硫酸法对纯化后的多糖进行检测，多糖得率28%。所述培养基消毒方式为在121℃下灭菌20min。[0007] 所述外植体的消毒方法为取铁皮石斛叶片，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理12分钟，无菌水冲洗5遍。
[0006]
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CN 103430852 A[0008]
说 明 书
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所述的稀土优选是镧稀土。
[0009] 所述多糖提取方法采用水提法提取，精密度RSD%为3.12%，重现性RSD%值为1.83%，稳定性RSD%值为3.8%。
[0010] 所述多糖测定方法为苯酚-硫酸法对铁皮石斛多糖进行检测，以葡萄糖标准液绘制标准曲线，加入1.5mL5%的苯酚溶液，硫酸5mL，显色温度80℃，在水浴中加热30min，在波长488nm下测定铁皮石斛多糖的含量，此种方法快速、显色稳定、重现性好、适用于铁皮石斛多糖含量的测定。
[0011] 所述纯化方法采用D301R树脂对多糖进行纯化，吸附液25℃，浓度5mg·mL－1，pH为7.0，吸附流度为1.8mL·min－1时吸附较强。[0012] 采用本发明制备的铁皮石斛悬浮细胞，增值速度快，多糖含量高，利于大生产操作，能耗小，污染小。
[0013] 下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施方式[0014] 实施例1
野外生长的铁皮石斛叶片，在MS培养基上，附加激素NAA 1mg/L，IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，诱导愈伤组织，诱导30天，继代4-5次，继代周期20天，取继代后的嫩绿松散的愈伤组织，加入White+TDZ0.5mg/l+IAA0.3mg/l，进行悬浮细胞培养，继代培养3次后，在培养基中加入1mg/l稀土，进行细胞多糖含量的，取样后采用水提法提取铁皮石斛多糖含量，提取时间为7.5 h，料液比为1：20，pH为8.5，使用树脂吸附法对多糖进行纯化，D301R树脂对铁皮石斛多糖吸附量大，氯化钠洗脱效果最好，使用苯酚-硫酸法对纯化后的多糖进行检测，多糖得率21.23%。[0015] 实施例2
野外生长的铁皮石斛叶片，在MS培养基上，附加激素NAA 1mg/L，IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，诱导愈伤组织，诱导30天，继代4-5次，继代周期20天，取继代后的嫩绿松散的愈伤组织，加入White+TDZ0.5mg/l+IAA0.5mg/l，进行悬浮细胞培养，继代培养3次后，在培养基中加入1mg/l稀土，进行细胞多糖含量的，取样后采用水提法提取铁皮石斛多糖含量，提取时间为7.5 h，料液比为1：20，pH为8.5，使用树脂吸附法对多糖进行纯化，D301R树脂对铁皮石斛多糖吸附量大，氯化钠洗脱效果最好，使用苯酚-硫酸法对纯化后的多糖进行检测，多糖得率22.56%。[0016] 实施例3
野外生长的铁皮石斛叶片，在MS培养基上，附加激素NAA 1mg/L，IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，诱导愈伤组织，诱导30天，继代4-5次，继代周期20天，取继代后的嫩绿松散的愈伤组织，加入White+TDZ1mg/l+IAA0.3mg/l，进行悬浮细胞培养，继代培养3次后，在培
进行细胞多糖含量的，取样后采用水提法提取铁皮石斛多糖养基中加入1mg/l稀土，
含量，提取时间为7.5 h，料液比为1：20，pH为8.5，使用树脂吸附法对多糖进行纯化，D301R树脂对铁皮石斛多糖吸附量大，氯化钠洗脱效果最好，使用苯酚-硫酸法对纯化后的多糖进行检测，多糖得率23.14%。
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CN 103430852 A[0017]
说 明 书
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实施例4
野外生长的铁皮石斛叶片，在MS培养基上，附加激素NAA 1mg/L，IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，诱导愈伤组织，诱导30天，继代4-5次，继代周期20天，取继代后的嫩绿松散的愈伤组织，加入White+TDZ1mg/l+IAA0.5mg/l，进行悬浮细胞培养，继代培养3次后，在培养基中加入1mg/l稀土，进行细胞多糖含量的，取样后采用水提法提取铁皮石斛多糖含量，提取时间为7.5 h，料液比为1：20，pH为8.5，使用树脂吸附法对多糖进行纯化，D301R树脂对铁皮石斛多糖吸附量大，氯化钠洗脱效果最好，使用苯酚-硫酸法对纯化后的多糖进行检测，多糖得率23.95%。[0018] 实施例5
野外生长的铁皮石斛叶片，在MS培养基上，附加激素NAA 1mg/L，IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，诱导愈伤组织，诱导30天，继代4-5次，继代周期20天，取继代后的嫩绿松散的愈伤组织，加入White+TDZ1mg/l+IAA0.3mg/l，进行悬浮细胞培养，继代培养3次后，在培养基中加入1mg/l稀土，进行细胞多糖含量的，取样后采用水提法提取铁皮石斛多糖含量，提取时间为7.5 h，料液比为1：20，pH为8.5，使用树脂吸附法对多糖进行纯化，D301R树脂对铁皮石斛多糖吸附量大，氯化钠洗脱效果最好，使用苯酚-硫酸法对纯化后的多糖进行检测，多糖得率25.79%。[0019] 实施例6
野外生长的铁皮石斛叶片，在MS培养基上，附加激素NAA 1mg/L，IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，诱导愈伤组织，诱导30天，继代4-5次，继代周期20天，取继代后的嫩绿松散的愈伤组织，加入White+TDZ1.5mg/l+IAA1.0mg/l，进行悬浮细胞培养，继代培养3次后，在培养基中加入1mg/l稀土，进行细胞多糖含量的，取样后采用水提法提取铁皮石斛多糖含量，提取时间为7.5 h，料液比为1：20，pH为8.5，使用树脂吸附法对多糖进行纯化，D301R树脂对铁皮石斛多糖吸附量大，氯化钠洗脱效果最好，使用苯酚-硫酸法对纯化后的多糖进行检测，多糖得率27.61%。[0020] 实施例7
野外生长的铁皮石斛叶片，在MS培养基上，附加激素NAA 1mg/L，IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，诱导愈伤组织，诱导30天，继代4-5次，继代周期20天，取继代后的嫩绿松散的愈伤组织，加入White+TDZ1.5mg/l+IAA1.0mg/l，进行悬浮细胞培养，继代培养3次后，在培养基中加入3mg/l稀土，进行细胞多糖含量的，取样后采用水提法提取铁皮石斛多糖含量，提取时间为7.5 h，料液比为1：20，pH为8.5，使用树脂吸附法对多糖进行纯化，D301R树脂对铁皮石斛多糖吸附量大，氯化钠洗脱效果最好，使用苯酚-硫酸法对纯化后的多糖进行检测，多糖得率27.52%。
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