hmgb1、tlr2和tlr4在银屑病中的表达及作用机制研究

单核细胞上Toll样受体（Toll-like receptor TLR2）、Toll样受体（Toll-like receptor TLR4）的表达，评价其在银屑病的发病机制和22，44，病情进展中的作用。方法　选取银屑病患者40例，近1个月内未发生感染的健康志愿者20例。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中HMGB1蛋白的表达，采用流式细胞术分析外周血单核细胞上TLR2、TLR4的表达。采用Pearson相关性分析其与银屑病临床及实验室指标之间的相关性。结果　进行期组银屑病患者血清HMGB1表达水平较病情退行期组和对照组明显增高（P＜0.05），而退行期组和对照组之间血清HMGB1表达水平无明显差异（P＞0.05）；进行期组患者血清HMGB1表达水平与ESR、RF和CRP、PASI评分等呈正相关（P＜0.05）；进行期组银屑病患者外周血单核细胞TLR2和TLR4的表达较退行期组和对照组相比呈上调趋势，而TLR2和TLR4的表达水平在银屑病退行期组和对照组之间无差异；血清中HMGB1的表达水平与单核细胞表面TLR2、TLR4的表达呈正相关。结论　血清HMGB1和外周血单核细胞表面TLR2、TLR4均参与了银屑病的病理过程，血清HMGB1和外周血单核细胞表面TLR2和TLR4表达水平增高与银屑病的发病及病情发展有关。HMGB1可能与银屑病患者体内异常的免疫反应有关。血清HMGB1和外周血单核细胞表面TLR2、TLR4的表达在银屑病发病机制中可能具有协同作用。【关键词】　高迁移率族蛋白1；Toll样受体；银屑病；表达

中图分类号：R751.02；R758.63　　文献标志码：A　　doi：10.3969/j.issn.1002-1310.2019.06.001

Exploring the expression levels of HMGB1, TLR2 and TLR4 and their mechanisms in psoriasis

SHU Chun-mei, ZHANG Chang-xi, ZHANG Yu-jie, WANG-Jing, MA Lei※

（Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256603, China）

【Abstract】　Objective By detecting the expression of high mobility group box chromosomal protein (HMGB1) in serum，Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 in monocyte derived macrophage in psoriasis patients，to evaluate its role in the pathogenesis and disease progression in psoriasis. Methods A total of 40 patients with psoriasis were selected, and the control group was 20 healthy volunteers without infection in the last 1 months. Enzyme linked ELISA was used to detect the expression of HMGB1 in serum and the expression of TLR2 and TLR4 in peripheral blood mononuclear cells was analyzed by flow cytometry. Correlation between clinical and laboratory indexes of psoriasis was using Pearson correlation analysis. Results The expression level of HMGB1 in patients with psoriasis in the progressive group was significantly higher than that in the degeneration group and the control group (p<0.05), and there was no difference in the expression of HMGB-1between the degeneration group and control group (p>0.05); the expression of serum HMGB-1 was positive correlated with ESR, RF, CRP, and PASI scores in the progressive group (p<0.05); the expression of TLR2 and TLR4 in progressive group was up-regulat-ed compared with that in the degenerative group and the control group, while the expression of TLR2 and TLR4 had no difference between the degenerative group and the control group; The expression level of HMGB1 in serum was positively correlated with the expression of TLR2 and TLR4 on monocyte surface. Conclusion The serum HMGB1 level and expression of TLR2 and TLR4 of peripheral blood mononuclear cell surface were involved in the pathogenesis of psoriasis, the upregulated of HMGB-1, TLR2 and TLR4 was related with the occurrence and development of psoriasis. HMGB-1 may be associated with abnormal immune responses in patients with psoriasis. And the serum levle of HMGB-1 and expression of TLR2 and TLR4 on the surface of peripheral blood mononuclear cells may play a synergistic role in the pathogenesis of psoriasis.【Key words】　High mobility group protein 1; Toll-like receptor; Psoriasis; Expression

银屑病是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病，男女发病率相当，初发年龄以（15～45）岁居多，发生银屑病时，患者和家庭承受沉重的精神压力和经济负担。其确切病因不清，目前认为是遗传、感染、精神因素、吸烟、药物等多因素诱发的免疫介导性疾病，研究表明[1、2]银屑病的发病机制涉及多种炎症细胞和炎性因子，但具体发病机制尚不明了。

高迁移率族蛋白（High mobility group protein，HMG）广泛存在于在真核动物中，在进化过程中高度保守。HMG各家族均具有重要的核内生物学功能，包括复制、转录、重组等。目前有关HMGB1的相关临床研究主要集中在风湿病、肿瘤、感染性疾病等

方面，与免疫性皮肤病的关系探讨较少[3、4]。TLR2

和TLR4均为HMGB1的配体，是Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）家族的重要成员，主要表达于单核巨噬细胞表面。TLRs是最近发现的一种天然免疫受体，通过识别并聚集病原相关的分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMPS）偶联信号转导途径来激活天然免疫细胞，从而产生一

[5]

系列的免疫炎症反应。本研究通过比较分析银屑病患者与健康对照组血清中HMGB1及PBMC表面TLR2、TLR4的表达，初步探讨HMGB1在银屑发病中的作用，完善HMGB1/TLR通路在银屑病发病机制方面的研究。

【收稿日期】2019-03-05　※通信作者　★基金项目：滨州医学院科技计划（BY2013KJ16）

782·论　著·

皮肤病与性病　2019年12月第41卷第6期　J Dermatology and Venereology,Dec 2019,Vol. 41,No,6

1　材料与方法

1.1　主要试剂　酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（购自美国Ebioscience）。荧光素FITC小鼠抗人CD14单抗（克隆号H1221，购自天津协和干细胞基因工程有限公司），TLR2-PE（克隆号TL2.1，购自abcam公司）；TLR4-PE（克隆号TL4.2，购自abcam公司）。

1.2　主要仪器　Synergy HT多功能酶标仪，美国BioTek公司；FACSCantoTM II流式细胞仪，美国BD公司。

1.3　标本来源

1.3.1　患者及对照选择　选择寻常型银屑病患者40例，其中男9例，女31例，年龄（13～70）岁，平均经组织病理证实诊断，无严重肝、肾功能不全、自身免疫性疾病及急慢性感染性疾病。分为进行期20例，退行期20例，分期标准参照《皮肤性病学》（第8版）。所有银屑病患者近2个月内未系统服用维A酸、糖皮质激素、免疫抑制剂等，2周内未使用外用药。另取20例无免疫性疾病等疾病，无银屑病家族史的健康志愿者作为对照组，男5例，女15例，年龄（18～61）岁，平均近1个月内未发生感染。对照组与银屑病组在性别及年龄上无显著性差异。

1.3.2　标本采集　所有受试者空腹抽取静脉血：EDTA抗凝血2ml（TLR2、TLR4），枸橼酸盐抗凝血2ml（ESR），普通生化管6ml（HMGB1、RF及CRP等）。1.4　ELISA检测血清　HMGB1的表达取银屑病患者及对照组于清晨空腹抽取的新鲜静脉血2ml，离心分离血清，4℃以半径10cm、2 500r/min离心10min后，取上清液100μl生物素化抗体工作液，27℃孵育60min，洗涤3次；加入100μl酶结合物工作液，37℃孵育30min，洗涤5次；加入90μl底物溶液，37℃孵育15min，加入50μl终止液，置于酶标仪450nm波长处测量吸光度，计算HMGB1的相对含量。

1.5　流式细胞术检测TLR2、TLR4的表达　采集EDTA抗凝血2ml，分别取100μl置入4个流式试管中，编号（1～4）号，各加入10μl CD14-FITC抗体。1、3号分别加入10μl抗人TLR2-PE抗体，TLR4-PE抗体；2、4号管中分别加入10μl PE标记的抗小鼠IgG2a。室温下静止染色15min，各加入溶血素3ml，再次混匀静置15min，以2 000r/min离心5min，弃去上清液，PBS洗涤后加入PBS 500μl混匀，在Cytomics FC500型流式细胞上测定外周血单核细胞中抗人CD14-FITC抗体和抗人TLR2/抗人TLR4/抗人抗体染色双阳性细胞百分率。

1.6　其他指标　ESR、RF、CRP等数据从我院检验科获得；记录患者PASI评分、是否合并感染、关节炎、心血管系统症状、神经系统症状等。

1.7　统计学处理　采用SPSS 20.0软件处理，计量资料以均值±标准差表示。多组间比较样本采用单

因素方差分析（One-Way ANOVA），t检验进行两两比较。变量间的相关分析采用Spearman相关分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。2　结果

2.1　HMGB1蛋白在银屑病患者及健康对照者血清中的表达　进行期组银屑病患者血清HMGB1浓度水平较退行期组和对照组呈明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01），对照组与退行期组差异无统计学意义（P＞0.05）。各组间HMGB1血清水平比较，见表1。

表1　三组间HMGB1血清浓度的比较（x±s）

组别

对照组退行期组进行期组n

2020

20

HMGB1浓度（μg/L）

13.46±3.58

14.82±1.48.93±11.30ab

注：与对照组比较aP＜0.05；与退行期组比较bP＜0.05。

2.2　TLR2、TLR4在CD+14单核细胞上的表达　进行期组银屑病患者外周血单核细胞TLR2和TLR4的表达与退行期组和对照组比较呈上调趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）；而两者表达水平在银屑病退行期组和对照组无差异（P＞0.05），见表2。

表2　三组间TLR2、TLR4在CD14+单核细胞上表达率的比较

（x±s）

组别

对照组退行期组进行期组

n202020TLR2表达率（%）83.27±9.9483.48±9.06.7±1.29abTLR2蛋白相对表达量0.91±0.090.94±0.071.09±0.12abTLR4表达率（%）11.85±5.22.83±10.4763.99±3.95ab

TLR4蛋白相对表达量

0.92±0.13

1.01±0.05

1.58±0.11ab

注：与对照组比较，aP＜0.05；与退行期组比较，bP＜0.05。

2.3　相关性分析

2.3.1　进行期组银屑病患者血清HMGB1表达与单核细胞表面TLR2、TLR4表达相关分析　进行期组银屑病患者血清HMGB1的表达水平与单核细胞表面TLR2、TLR4的表达均成正相关（P＜0.05），见表3。

表3　血清中HMGB1水平与单核细胞表面TLR2、TLR4相

关性分析

血清HMGB1

TLR2蛋白相对表达量

TLR4蛋白相对表达量

r0.5510.483P

0.012

0.031

2.3.2　进行期组银屑病患者血清HMGB1表达与临床指标相关分析　进行期组银屑病患者血清HMGB1水平与ESR、RF、CRP、PASI评分成正相关（P＜0.05）。与感染、关节炎症状、心血管症状、神经症状成正相关，无统计学意义（P＞0.05），见表4。3　讨论

HMG广泛存在于真核动物生物中，在进化过程中高度保守，HMG各家族均具有重要的核内生物学

（33±14）岁。临床表现典型，（34±12）岁，皮肤病与性病　2019年12月第41卷第6期　J Dermatology and Venereology,Dec 2019,Vol. 41,No,6表4　血清HMGB1表达与临床指标相关性分析血清HMGB1rPESR0.411＜0.05RF0.353＜0.05CRP0.437＞0.05PASI评分0.459＜0.05感染0.257＞0.05关节炎症状0.113＞0.05·论　著·783心血管症状0.102＞0.05神经症状0.109＞0.05功能，包括复制、转录、重组等。HMGB1是HMG家族中的重要成员，近年来发现其为一种重要的炎症递质，与组织损伤后修复、炎症反应密切相关，HMGB1既可作为早期启动因子从坏死细胞中被动释放，也可在TNF-α、IL-1等刺激下作为晚期炎症介质由单核/巨噬细胞等主动分泌[6]。目前有关HMGB1的相关临床研究主要集中在肿瘤、风湿病、感染性疾病等方面，与免疫性皮肤病的关系探讨较少。国内外研究表明，HMGB1与系统性红斑狼疮（SLE）[7]、类风湿性关节炎（RA）[8]、皮肤炎[9、10]、白塞病[11]关系密切，其水平与病情活动有关。严伟强等[12]

曾探讨银屑病患者血清中HMGB1含量的变化与银屑病的关系，发现银屑病患者较对照组进行期、静止期血清中HMGB1水平明显升高，初步表明该因子与病情密切相关。

TLR2和TLR4均为HMGB1的配体，是TLRs家族的重要成员，主要表达于单核巨噬细胞表面。TLRs是最近发现的一种天然免疫受体，通过识别并聚集PAMPS耦合的信号通路来激活天然免疫细胞，导致一系列的免疫炎症反应。目前对TLRs的研究主要集中在TLR2和TLR4。研究发现在银屑病皮损中TLR2、TLR4均有表达，TLR4的表达更高，提示感染相关免疫与银屑病发病密切相关。

研究表明，HMGB1可表达于细胞膜上或释放于细胞外，参与某些细胞的分化、迁移、再生，并可介导炎症反应。HMGB1作为晚期释放的炎症介质，已被确认银屑病致死效应的关键因子[13]。TLR2、TLR4是近年来备受关注的病原体识别受体[7]。TLR2识别谱较广，可识别大部分现已发现的PAMP结构，如G+菌的PGN、分支杆菌和疏密螺旋体的脂蛋白、酵母菌和支原体的某些成分等；TLR4的配体包括LPS、呼吸道合胞病毒蛋白F、透明质酸酶、硫酸肝素、纤维蛋白原、酵母多糖、白色念珠菌以及宿主来源的热休克蛋白60、纤维连接蛋白等。HMGB1既是TLR2的配体，也是TLR4的配体。

新近的研究证实巨噬细胞Toll样受体（TLR2

和TLR4）参与HMGB1的识别，荧光能量共振转移和免疫沉淀反应显示了HMGB1和TLR2、TLR4分子表面的相互作用。研究还发现[14]，TLR2和TLR4在HMGB1诱导的巨噬细胞和中性粒细胞NF-κB的活化中起主要作用。抗TLR4抗体可阻止巨噬细胞活化及致炎细胞因子的释放，并能够阻断脓毒症所导致的休克。由此推测TLR可能参与HMGB1的信号转导过程。

本研究通过银屑病患者外周血清HMGB1蛋白的检测，探讨银屑病患者HMGB1的变化。结果显

示，进行期银屑病患者血清HMGB1水平明显高于退行期银屑病患者和健康对照者，由此推测，进行期银屑病患者PBMC合成HMGB1增加，在受到某些促炎因子的影响时，HMGB1由胞核进入胞质，最后释放到血清中，导致血清HMGB1水平升高。本研究检测银屑病患者及健康对照组外周CD+14单核细胞表面TLR2和TLR4的表达，发现进行期组银屑病患者TLR2、TLR4表达率及蛋白相对含量均显著高于退行期组银屑病患者和健康对照者，从而提示TLR2、TLR4的表达与银屑病病情的发生、发展和转归有一定关系。推测TLR2、TLR4可增强外周血单核细胞的活化和下游信号传导效应，并通过激活TLRs信号通路参与银屑病的病情进展。有关TLRs信号通路对银屑病进展的影响及其机制的研究已陆续见有报道，但TLR2和TLR4表达增高究竟如何影响下游细胞因子和细胞免疫功能，有待进一步研究。

本研究相关分析表明：在进行期银屑病患者中HMGB1与TLR2、TLR4的表达呈正相关，说明HMGB1与TLR2、TLR4在进行期银屑病患者中的表达是同步的，推测当某些因子刺激PBMC合成HMGB1后，会导致其大量释放入血，HMGB1可能通过外周血单核细胞等细胞膜上的TLR2、TLR4进行信号传导，激活下游炎症介质释放的瀑布效应。本研究对血清中HMGB1的表达与银屑病的活动相关指标进行了相关性分析，结果表明发现血清中HMGB1的表达与ESR、CPR、RF呈正相关。ESR、CPR、RF是反映RA炎症程度的重要指标，因此我们认为血清中HMGB1也可作为评价银屑病病情活动的指标之一。

综上所述，本研究提示HMGB1/TLR通路可能是银屑病发病中炎症信号的重要启动因素，探讨其在银屑病发生和发展中的确切机制及信号转导途径，进而研制出一种阻断或抑制该途径激活的药物，对阻断银屑病炎症的进一步放大，阻止基质降解，减慢骨质破坏，有效预防和治疗银屑病有一定意义。

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昆明地区2型糖尿病老年住院患者口腔真菌定植危险因素及药敏研究★1杨宏军1，曹蜀吴1，张虎山2，王红梅1，李玉叶1

（1.昆明医科大学第一附属医院，云南　昆明　650031；2.复旦大学基础医学院，上海　200032）

【摘要】　目的　研究2型糖尿病老年住院患者真菌定植及分布情况，分析真菌定植的高危因素及药敏情况，指导真菌感染的防治。方法　采用口腔黏膜拭子法，对88例2型糖尿病老年住院患者进行取材，采用CHROMagar念珠菌显色培养基及API 20C AUX酵母菌鉴定系统对念珠菌进行培养、分离、纯化和鉴定。采用肉汤微量稀释法进行抗真菌药物敏感性试验。结果　2型糖尿病老年住院患者88例中，检出口腔真菌定植有48例，其定植真菌菌种鉴定结果为，白念珠菌占87.5%，**滑假丝酵母菌占8.3%，酿酒酵母菌占4.2%；检出真菌定植的患者中，与2型糖尿病患者口腔真菌定植相关的危险因素主要为是否合并其他疾病（P＜0.05），单一2型糖尿病组与合并其他疾病组定植率存在显著性差异；白念株菌对伊曲康唑耐药率19%，氟康唑和伏立康唑为14.3%。结论　2型糖尿病老年住院患者真菌定植问题普遍存在，其最常见的口腔定植真菌是白念珠菌，主要危险因素是合并其他疾病，尤其是否合并有肺部相关疾病史，其敏感药物为两性霉素B，对伊曲康唑、氟康唑和伏立康唑有一定耐药性。【关键词】　2型糖尿病；老年；真菌定植；危险因素

中图分类号：R587.2；R781.5+4　　文献标志码：A　　doi：10.3969/j.issn.1002-1310.2019.06.002

Risk factors and drug sensitivity of oral fungal colonization in elderly inpatients with type II diabetes in Kunming

YANG Hong-jun1, CAO Shu-wu1, ZHANG Hu-shan2, WANG Hong-mei1, LI Yu-ye1

（1.First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming,Yunnan 650031;2. Basic Medical College, Fudan University, Shanghai 200032）【Abstract】　Objective To study the colonization and distribution of fungi in hospitalized elderly patients with type 2 diabetes mellitus, analysis of the risk factors and drug resistance of fungal colonization, to guide the prevention and treatment of fungal infections. Methods A total of 88 elderly inpatients with type 2 diabetes mellitus were drewed samples by oral mucosal swab method. The culture, isolation, purification and identification of Candida were carried out using CHROMagar Candida chromogenic medium and API 20C AUX yeast identification system. The antifungal drug sensitivity test was carried out us-ing a broth microdilution method. Results Among the 88 elderly inpatients with type 2 diabetes mellitus, 48 cases of oral fungal colonization were detected, and the results of identification of the colonized fungal strains were 87.5% of Candida albicans, 8.3% of Candida parapsilosis, and Saccharomyces cerevisiae. 4.2%; among the patients with fungal colonization, the risk factors associated with oral fungal colonization in patients with type 2 diabetes mellitus were mainly other combined with other diseases (p<0.05), and the colonization rate of single type 2 diabetes group and other disease groups was significant. The resistance rate of Candida albicans to itraconazole was 19%, and that of fluconazole and voriconazole was 14.3%. Conclusion C.albicans is the most com-mon fungus in elderly inpatients with type 2 diabetes mellitus. Accompanying with other diseases is the high risk factors of oral fungal colonization in elder-ly inpatients with type 2 diabetes mellitus. The fungi in the group of elderly inpatients with type 2 diabetes mellitus are sensitive to amphotericin.

【收稿日期】2009-10-15　★基金项目：1.云南省卫生计生委内设研究机构基金项目（2017NS017）；2.云南省基础研究计划-昆医联合专项（2018FE001（-044））；3.云南省创新团队（2018HC005）；4.云南省卫生计生委项目（L-201613）