考点一基因工程的概念及操作工具

(2015天津、福建、重庆、浙江、江苏；2014新课标、天津、北京、山东、江苏、海南；2013全国大纲卷、广东……)

一、基因工程的概念

基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 原理 基本过程 结果 供体 受体 本质 优点 二、DNA重组技术的基本工具 1．性核酸内切酶(简称：酶)

基因拼接技术或DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 基因重组 剪切→拼接→导入→表达 人类需要的基因产物或生物类型 提供目的基因 表达目的基因 目的基因在受体体内的表达 可定向改造生物的遗传性状 作用：割断两个核苷酸之间的磷酸二酯键

作用特点：专一性，即酶可识别特定的核苷酸序列错位切：产生两个相同的黏性末端

结果 平切：形成平末端

2．DNA连接酶

常用类型 来源 功能 结果 3.载体

(1)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。

E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 连接黏性末端 来源：主要从原核生物中分离

T4DNA连接酶 T4噬菌体 连接黏性末端或平末端 都缝合磷酸二酯键，如图 能自我复制

(2)质粒的特点有一个至多个酶切割位点

有特殊的标记基因

1．下图为酶和DNA连接酶的关系，据图回答：

(1)酶和DNA连接酶的作用部位相同吗？相同。 (2)DNA连接酶起作用时是否需要模板？不需要。 2．探究载体所具条件的意义

条 件 稳定并能自我复制 有一个至多个酶切割位点 具有特殊的标记基因 基因工程操作工具的综合考查

导学号(经典高考题)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

(1)性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。 (2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：

AATT C……G

G……CTTAA

意 义 目的基因稳定存在且数量可扩大 可携带多个或多种外源基因 便于重组DNA的鉴定和选择 为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是______________________________。

(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。

(4)反转录作用的模板是________，产物是_____________________________________。 若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。 (5)基因工程中除质粒外，________和________也可作为运载体。

(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细

胞

，

原

因

是

____________________________________________________________________。

1．酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较 名称 酶 作用部位 磷酸二酯键 作用底物 DNA 作用结果 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA酶 解旋酶 RNA聚合酶 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对之间的氢键 磷酸二酯键 DNA片段 脱氧核苷酸 DNA DNA 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部分解为两条长链 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端

2.酶选择的注意事项 (1)根据目的基因两端的酶切点确定酶的种类

①应选择切点位于目的基因两端的酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。

(2)根据质粒的特点确定酶的种类

①所选酶要与切割目的基因的酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中酶Sma Ⅰ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )

A．①②③④ C．①④②③

B．①②④③ D．①④③②

若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(AGATCT)、EcoRⅠ(GAATTC)和Sau3AⅠ(GATC)。下列分析合理的是( )

A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体

已知一双链DNA分子，用酶Ⅰ切割得到长度为120 kb(kb：千碱基对)片段；用酶Ⅱ切割得到40 kb和80 kb两个片段；同时用酶Ⅰ和酶Ⅱ切割时，得到10 kb、

↓

↓

↓

80 kb和30 kb 3个片段。据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为( )

下列关于载体的叙述中，错误的是( )

A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子

B．对某种酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点 C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒 D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割

考点二 基因工程的基本操作程序及应用(5年24考)

(2015新课标Ⅰ、福建、天津、四川、海南、江苏；2014新课标、天津、广东、重庆、北京、山东、江苏、海南；2013新课标Ⅰ、福建……)

1．操作步骤：获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。

2．应用 技术名称 植物基因工程 应用 培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质 提高动物生长速度，改善畜产品的品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体 把正常基因导入病人体内，使其表达产物发挥作用，从而治疗疾病，分为体内基因治疗和体外基因治疗 动物基因工程 基因治疗 1．观察基因工程的操作过程，分析每一步骤的操作程序

①从基因文库中获取

?1?获取目的基因—②利用PCR技术扩增

③通过化学方法人工合成 ↓

②启动子

?2?基因表达载体的构建—组成③终止子

④标记基因

①目的基因

↓

①植物：农杆菌转化法、基因 法、花粉管通道法将目的基因导

?3?—方法入受体细胞②动物：显微注射技术

③微生物：感受态细胞法 ↓

基因的有无



②利用分子杂交技术检测目的基因的目的基因的 转录

?4?

检测与鉴定③利用抗原—抗体杂交技术检测目的基

 因的翻译

④利用个体生物学水平的鉴定检测重 组性状的表达

2．目的基因的检测和鉴定

3．探究基因治疗与基因诊断的不同点

基因治疗 原理 基因表达 操作过程 ①利用DNA分子杂交技术检测目的

进展 临床实验 利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗 制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况 基因诊断 碱基互补配对 临床应用 基因工程的操作程序的考查

导学号(2015·四川卷)将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示(注：农杆菌中Ti质粒上只有T-DNA片段能转移到植物细胞中)。

(1)过程①需用同种____________酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用________培养基。

(2)过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让________进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是________________________________________________________________________。

(3)若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加________以获得芽；部分接种在无

激素培养基上的芽也能长根，原因是_________________________________________。

(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是____________。种植转基因抗虫棉能减少________的使用，以减轻环境污染。

下图表示用化学方法合成目的基因Ⅰ的过程。据图分析，下列叙述正确的是( )

A．过程①需要DNA连接酶 B．过程②需要性核酸内切酶 C．目的基因Ⅰ的碱基序列是已知的

D．若某质粒能与目的基因Ⅰ重组，则该质粒和目的基因Ⅰ的碱基序列相同 下列用于判断目的基因是否转移成功的方法中，不属于分子检测的是( ) A．通过害虫吃棉叶看其是否死亡

B．转基因生物基因组DNA与DNA探针能否形成杂交带 C．转基因生物中提取的mRNA与DNA探针能否形成杂交带 D．转基因生物中提取的蛋白质能否与抗体形成杂交带

(2014·天津卷)为达到相应目的，必须通过分子检测的是( ) A．携带链霉素抗性基因受体菌的筛选

B．产生抗人白细胞介素-8抗体的杂交瘤细胞的筛选 C．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定 D．21三体综合征的诊断

(2015·福建卷)GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图1所示)，并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：

(1)在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是__________________。

(2)构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的________酶进行酶切。 (3)经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有3种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。为鉴定这3种连接方式，选择HpaⅠ酶和BamHⅠ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第________泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。

(4)将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的________与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行

________培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。

考点三 蛋白质工程、转基因技术的安全性及生物武器(5年6考)

(2015新课标Ⅱ、海南；2014重庆；2013广东、江苏……)

1．概念理解 蛋白质工程 别称 目标 原理 基础 手段 关键技术 基础 结果 具体内容 第二代基因工程 生产符合人类生产和生活需要的一种新的蛋白质 由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质结构进行改造，必须从基因入手 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质 基因工程 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质 2.操作过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。

3．转基因技术的安全性 (1)安全性问题

①食物安全：滞后效应、过敏原、营养成分改变等。 ②生物安全：对生物多样性的影响等。 ③环境安全：对生态系统稳定性的影响等。 (2)理性看待转基因技术

①需要正确的社会导向：趋利避害，不能因噎废食。 ②制定和法规，最大程度保证转基因技术和产品的安全性。 4．生物武器

(1)生物武器的种类(连线)

(2)生物武器的特点

①致病力强、传染性大，②污染面广、危害时间长，③难以防治，④具有一定的潜伏期，⑤受自然条件影响大。

探究蛋白质工程与基因工程的区别和联系

项目 蛋白质工程 预期蛋白质的功能→设计预期的蛋基因工程 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 过程 区别 实质 结果 联系 白质结构→推测应有的氨基酸序列→推测相对应的脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 生产自然界中没有的蛋白质 生产自然界中已有的蛋白质 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，都必须通过基因修饰或基因合成来实现 蛋白质工程的考查

导学号(2015·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氮酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有酶的催化活性。回答下列问题：

(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。

(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________________的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：________________________________________。

(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过____________和____________进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________________进行鉴定。

1．转基因生物存在安全性问题的原因

(1)目前对基因的结构、机制及基因间的相互作用了解有限。 (2)目的基因往往是异种生物的基因。

(3)外源基因插入宿主细胞基因组的部位往往是随机的。 2．转基因生物的优缺点

优点 ①解决粮食短缺问题； 缺点 ①可能出现新的过敏原或重组形成新病毒； ②大大减少农药的使用量，减少环境污染； ②可能产生抗除草剂的杂草； ③增加食物营养，提高附加值； ③可能使疾病的传播跨越物种障碍； ④增加食物种类，提升食物品质； ⑤提高生产效率，带动相关产业发展 ④可能会损害生物多样性； ⑤可能会对人类生活环境造成二次污染 (经典高考题)下列关于转基因生物安全性的叙述中，错误的是( ) A．我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度 B．国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害 C．开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提 D．目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上

(2015·海南卷)在体内，人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链，此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原，进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后，产生A、B两条肽链，再经酶丙作用生成由51个氨基酸残基组成的胰岛素。目前，利用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题：

(1)人体内合成前胰岛素原的细胞是________，合成胰高血糖素的细胞是________。 (2)可根据胰岛素原的氨基酸序列，设计并合成编码胰岛素原的____________序列，用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体。再经过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立能稳定合成____________的基因工程菌。

(3)用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时，培养液无抗原抗体反应，菌体有抗原抗体反应，则用该工程菌进行工业发酵时，应从________中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。

巧辨基因工程操作基本工具的8个易错点 (1)酶是一类酶，而不是一种酶。

(2)酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。

(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。 (5)不同DNA分子用同一种酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的酶切割，产生的黏性末端一般不相同。

(6)酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。

(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。 规避与基因工程操作有关的7个失分点

(1)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。

(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。

(3)原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。 (4)转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。

(5)一般情况下，用同一种酶切割质粒和含有目的基因的片段，但有时可用两种酶分别切割质粒和目的基因，这样可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。

(6)不熟悉标记基因的种类和作用：标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。

(7)还应注意的问题有：①基因表达载体中，启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。②基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。

(2015·重庆垫江一模)草甘膦是一种广谱除草剂，其除草机制是抑制植物体内EPSPS酶的合成，最终导致植物死亡。但是，它的使用有时也会影响到植物的正常生长。目前，已发现可以从一种抗草甘膦的大肠杆菌突变株中分离出EPSPS基因，若将该基因转入植物细胞内，从而获得的转基因植物就能耐受高浓度的草甘膦。取6株植物，其中，植物A和D对草甘膦敏感，B和E对草甘膦天然具有抗性，C和F则经过了转基因处理，但是是否成功还未知。图1为4种酶的识别序列和酶切位点，图2为含有目的基因的DNA片段及其具有的酶切点。据图回答下列问题：

图1

(1)若A～C浇清水，D～F浇的水中含有草甘膦，上述植物中，肯定能健康成长的是________。

(2)若要从大肠杆菌中筛选出含EPSPS基因的突变菌株甲，在大肠杆菌培养基中还必须加入________________。

(3)一个完整的基因表达载体除了具备复制原点、启动子和终止子外，还应包括________和________。

(4)若需利用酶切法获得目的基因，最应选择的酶是________和________。 (5)通常用________________法将EPSPS基因导入植物体内。假设EPSPS基因已被成功转移到植物F中，但植物F仍没有表现出抗性，分析可能的原因______________________。

图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列。图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请回答下列问

↓

↓

↓

↓

题：

(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由________________连接。 (2)若用酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是________末端，其产物长度为________________________________________________________________________。

(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用酶SmaⅠ完全切割，产物有________种不同长度的DNA片段。

(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是________________________________________。