牛乳快速测定的标准化

本文发表在《北京奶业》2012年第三期

牛乳快速测定的标准化

The standardization of quick determinationof raw milk

高星 郑建国 石桂兰 赵慧芬

（北京奶牛中心 100192）

摘要：本文参考国际标准，在牛乳快速测定的清洗效率、校准线性回归方程、校准有效性、稳定性日检查、精密度等牛乳快速测定的标准化工作方面做了大量试验。试验表明，只要保障仪器良好的清洗效率，做好校准工作和稳定性检查工作，就能够使样品检测数据与参比值具有良好的线性关系，并且符合国际标准在精密度上的要求。

关键词：牛乳；快速测定；标准化；精密度

牛乳快速测定既是奶牛育种的基础，又是乳品厂收购生鲜牛乳按质论价的依据。因此，如何保证牛乳快速测定数据的准确性就显得非常重要。目前行业内通常使用的牛乳快速测定仪多依据红外吸收测定原理。均质牛乳中甘油酯的羰基在5.7μm处（脂肪A）、碳氢CH基在3.5μm处（脂肪B）红外吸收测定脂肪；肽键的胺基在6.5μm处红外吸收测定蛋白质；乳糖的羟基在9.6μm处红外吸收测定乳糖。以上三个测定值加恒定含盐量后（一般为0.7%）计算出总固体含量。日常测定时，需要经常及定期检查仪器的运行状态，作必要的例行或定期监控工作，方可保障数据的准确。但目前各实验室的监控方法与内容及规定指标不一，因此应建立统一的全面的监控方法与标准，以便于实验室间的比对和交流，做好奶牛育种的基础性工作，做好全国青年公牛联合后裔测定工作。本文参考国际标准化组织标准《牛乳—脂肪、蛋白质和乳糖含量测定—中红外测定仪操作指南》即ISO 9622:1999(E) Whole milk-Determination of milkfat,protein and lactose content-Guidance on the operation of mid-infrared instruments、《乳与乳制品—抽样指南》即ISO 707:1997(E) Milk and milk products-Guidance on sampling和国际标准化组织标准《牛乳—体细胞计数 第2部分：电子粒子计数法》即ISO 13366-2:1997(E)Milk-Enumeration of somatic cells Part 2:Electronic particle counter method，结合实际测定工作（主要使用的是丹麦Foss公司生产的牛乳快速测定仪器），在牛乳快速测定的清洗效率、校准线性回归方程、校准有效性、稳定性日检查、精密度方面做了大量试验。试验表明，只要保障仪器良好的清洗效率，做好校准工作和稳定性检查工作，就能够使样品检测数据与参比值具有良好的线性关系，并且符合国际标准在精密度上的要求。本文为统一牛乳快速测定工作标准化的可行性提供了试验数据与内容，也便于同仁实验室的参考与借鉴。

1 清洗效率

清洗效率主要是指对仪器中样品池的清洗情况，以保证连续测定的样品之间互相不受影响。试验过程如下：将1个纯净水分成10个水样，将1个生鲜牛乳分成10个牛乳样，如下表1顺序成双相间排列。用牛乳快速测定仪连续测定以下排列样品中的脂肪、蛋白质、乳糖，测定数据见表1。

1

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表1 清洗效率实验结果

序号 1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

样品 水 水 牛乳 牛乳 水 水 牛乳 牛乳 水 水 牛乳 牛乳 水 水 牛乳 牛乳 水 水 牛乳 牛乳

符号 W1 W2 M1 M2 W1 W2 M1 M2 W1 W2 M1 M2 W1 W2 M1 M2 W1 W2 M1 M2

脂肪（%） 0.05 0.06 3.43 3.46 0.08 0.07 3.46 3.47 0.08 0.07 3.43 3.44 0.08 0.07 3.43 3.44 0.09 0.07 3.44 3.44

蛋白质（%） 0.25 0.24 3.04 3.06 0.27 0.26 3.05 3.06 0.27 0.26 3.05 3.07 0.28 0.26 3.05 3.06 0.28 0.26 3.05 3.06

乳糖（%） -0.26 -0.26 4.96 4.99 -0.22 -0.24 4.98 5.01 -0.21 -0.24 4.99 5.01 -0.21 -0.24 4.99 5.02 -0.21 -0.23 4.99 5.02

样品池清洗效率以Ε计，数值以％表示，按式（1）计算：

Ε=

式中：

M1—成双牛乳样的第一个测定值，单位为％； M2—成双牛乳样的第二个测定值，单位为％；

W2—成双水样的第二个测定值，单位为％。

E应在（100±1）％范围内。按式（1）计算本仪器在测定脂肪、蛋白质、乳糖的清洗效率分别为99.%、99.50%、99.47%，表明本仪器具有良好的清洗效率。如果清洗效率不能达标，应及时找供应商来解决问题。

MWMW1222×100--------------------------（1）

2校准线性回归方程

下面以脂肪校准为例来说明对校准后的线性回归方程的要求。因为仪器在测定脂肪、蛋白质、乳糖这三项中，最难达到线性关系的是脂肪。首先要称取200g全脂乳粉，溶于800mL水中，搅匀，制得复原乳。然后按表2中比例配制6个脂肪测定样品，各100mL。分别用牛乳快速测定仪和参比方法（GB/T 5409-1985 牛乳检验方法中2.3.2盖勃法）测定脂肪，试2

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验结果见表3。

表2 脂肪校准测定样品含量表（单位：mL）

样品号 复原乳 水 样品号 方法 仪器法，x 参比法，y

1 50 50

2 60 40

3 70 30

4 80 20

5 90 10

6 100 0

表3脂肪校准测定结果

浓 度 水 平 1 3.23 3.22

2 4.00 3.98

3 4.60 4.59

4 5.34 5.30

5 6.00 5.90

6 6.52 6.50

线性回归方程为Y=0.9854X+0.0004， 相关系数为0.9994。ISO标准中规定线性相关系数不低于0.9990。 线性回归方程的剩余标准差以Syx计，数值以质量分数（％）表示，计算公式见下。

Syx=

2yiaxib(n1)------------------(2)

式中：

yi—第i次参比方法测定的算术平均值，单位为％； xi—第i次牛乳快速测定仪测定的算术平均值，单位为％； a—线性回归方程的斜率； b—线性回归方程的截距； n—测定次数。

按式（2）计算，上述线性回归方程的剩余标准差为0.027%。 ISO标准中规定剩余标准差应不大于0.06％。否则，应由牛乳红外测定仪供应商校准或按其提供的方法自行校准。

3校准有效性的确认

校准周期一般为三个月。校准后，要对校准工作是否有效进行检验。通常以脂肪来检验，因脂肪的校准比蛋白质和乳糖更难达到要求。以测定的准确度判断校准有效性，应同时满足以下条件。

3.1 n个（≥6）试样的仪器测定值和参比方法测定值之差的算术平均值A不超

0.2过n。

计算公式如下式（3）：

yixiA= ------------------------------(3)

n

式中：

yi—第i次参比方法测定的算术平均值，单位为％；

xi—第i次牛乳快速测定仪测定的算术平均值，单位为％； n—测定次数。

3

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0.2 以表3中数据为例进行计算，A=0.032%，ISO标准中规定≤

n,即≤0.082。

3.2 n个（≥6）试样的仪器测定值和参比方法测定值之差的标准差S不超过0.1％。

计算公式如下式（4）：

S=

（yixi)(n1)2--------------------------(4)

式中： yi—第i次参比方法测定的算术平均值，单位为％； xi—第i次牛乳快速测定仪测定的算术平均值，单位为％； n—测定次数。

以表3中数据为例进行计算，S=0.034%，符合了要求。

4稳定性日检查

用质控样检查牛乳快速测定仪的稳定性。质控样是指在贮存期间主要理化特性不发生变化的牛乳样。可取生鲜牛乳加入防腐剂，制备成质控样，4℃条件下可保存二周或采用市售同批号超高温灭菌乳。每个工作日中每测定20个～100个样品后应测定一个质控样，制作成质控图，这样就可有效地判断牛乳红外测定仪是否发生飘移，并及时校准。适用于牛乳红外测定仪在一个工作日内或相邻工作日之间的稳定性检查。质控图由以下几部分组成： （I) 横坐标表示质控样测定次数，纵坐标表示仪器测定值。

（II) 上下个体线m0±Ic。Ic为个体值99％置信水平的置信区间，按式（5）和式（6）计算。

Ic=5.16Sr ------------------------------（5） Sr= 式中：

Sr —重复性条件下测定标准差，单位为％。

xi—表示质控样用牛乳快速测定仪测定的第i次数值，单位为％； m0—表示质控样用参比方法测定出来的数值。 n—测定次数。

（III) 上下置信带m0±Mc

Mc为累积测定平均值99％置信水平的置信区间，按式（7）计算：

（xim)02(n1) ---------------------（6）

ICMc=

式中：

n—质控样测定开始后的累积测定次数。

n-----------------------------------------------（7）

4

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作质控图时，将个体测定值x以“◆”形式标在相应次数的测定值上，依次用线连接。将累积测定平均值∑x/n以“■”形式标在相应次数的测定值上，依次以用线连接。根据上述内容操作，以质控样脂肪含量测定为例，试验结果如下表4。其中m0=3.80%。

表4 质控样脂肪含量测定结果

测定次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

个体测定值x

3.85 3.84 3.83 3.84 3.84 3.85 3.84 3.84 3.83 3.82 3.81 3.78 3.79 3.81 3.84 3.86 3.84 3.82 3.81 3.78

累积测定平均值∑x/n

3.85 3.84 3.84 3.84 3.84 3.84 3.84 3.84 3.84 3.84 3.84 3.83 3.83 3.83 3.83 3.83 3.83 3.83 3.83 3.83

Mc% 0.117 0.083 0.068 0.059 0.052 0.048 0.044 0.041 0.039 0.037 0.035 0.034 0.032 0.031 0.030 0.029 0.028 0.028 0.027 0.026

根据表4中数据按式（5）和式（6）计算， Sr =0.0230%, Ic=0.117%，按式（7）计算出各测定次数的Mc值已列入表4。依据以上计算画质控图，同时画出上、下个体线m0±Ic，上、下置信带m0±Mc。见图1。

3.9 3.85 3.8 3.75 3.7 3.65累计测定平均值个体测定值% 3.955 0510152025测定次数路漫漫其修远兮，吾将上下而求索 -

图1质控图

根据质控图判断，当个体测定值在上、下个体线内表明合格，否则不合格。当累积测定平均值在上、下置信带内表明合格，否则不合格。若个体测定值有三个或四个处于两种个体线附近或之外，说明质控样质量不佳，使仪器重复性变差。则须要制备新的质控样。若连续两个累积测定平均值处于同一（上或下）置信带之外，说明仪器发生飘移。此时，它们的个体测定值的偏离处于相同方向。则按上述1中内容测定样品池清洗效率，清洗样品池或更换之。若仪器调零后测定值又处于质控图限度之外，则停止运行，重新校准，且重新制作质控图。

5 测定精密度

5.1重复性条件下精密度

由表1可见脂肪测定的绝对差值均≤0.04%，蛋白质测定的绝对差值均≤0.03%，乳糖

测定的绝对差值均≤0.06%。达到了ISO标准规定的重复性条件下精密度≤0.06%的要求。

5.2再现性条件下精密度

用牛乳快速测定仪连续测定数个样品，24小时后 再行测定。分别计算脂肪1和脂肪2、蛋白质1和蛋白质2的标准差。试验结果见表5。可见脂肪测定的再现性条件下标准差均≤0.035%；蛋白质测定的再现性条件下标准差均≤0.035 %，分别达到了ISO标准规定的再现性条件下精密度≤0.045%和≤0.035%的要求。

表5 牛乳快速测定仪对脂肪1和脂肪2、蛋白质1和蛋白质2的连续测定结果

样品号 1 2 3 4 5 6 7 8 9

第1天 第2天（24小时后） 再现性标准差 脂肪1（%） 蛋白质1（%） 脂肪2（%） 蛋白质2（%） 脂肪（%） 蛋白质（%） 3.61 3.67 3. 3. 3.63 3.65 3.61 3.67 3.65

2.94 3.02 3.02 2.95 3.04 3.05 2.96 3.02 3.03

3.63 3.69 3.66 3.65 3.66 3. 3.66 3.68 3.

2.97 3.06 3.06 2.96 3.02 3.03 3.00 3.05 3.07

0.014 0.014 0.014 0.007 0.021 0.007 0.035 0.007 0.007

0.021 0.028 0.028 0.007 0.014 0.014 0.028 0.021 0.028

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