石蜡包埋组织中RNA提取方法的改进和完善

2005年6月JOURNALOFGUIYANGMEDICALCOLLEGE2005.6

石蜡包埋组织中RNA提取方法的改进和完善

孟 青，杨文秀，胡 军，高 勤

（贵阳医学院病理学教研室，贵州贵阳 550004）

［摘 要］目的：建立和完善石蜡组织RNA提取的方法。方法：收集临床病理诊断用石蜡包埋组织块共100例，

经RNA灭活处理后，进行组织切片、脱蜡、清洗、消化等一系列提取前预处理，用TRIZOL试剂提取组织的RNA，并在-20C长时间沉淀RNA。对提取的RNA以核酸测定仪检测RNA的浓度和纯度，并通过RT-PCR检查提取RNA的!-actin基因，以检测提取RNA的质量。结果：100例石蜡包埋组织中提取的RNA经过核酸测定仪测定后，浓度260nm及280nm光密度比在1.75~2.0；经过RT-PCR反应，提取的RNA都能扩增出190bp的在20~50mmoi/L，

从固定、石蜡包埋档案组织材料中!-actin目的片段。结论：通过RNA提取前对材料的一系列合理处理，

可以成为一种稳定成熟的方法应用于临床病理诊断。提取小片段RNA进行目的基因mRNA检测，

［关键词］RNA，肿瘤；石腊包埋；逆转录聚合酶链反应

［中图分类号］R730.23 ［文献标识码］A ［文章编号］1000-2707（2005）03-0241-03

TheImprovementofIsolationTechnigueofRNAfromFormalin-fixed

andParaffin-embeddedTissues

MENGOing，YANGWen-xiu，HUJun，GAOOin

（DepartmentofPathology，GuiyangMedicalCollege，Guiyang550004，China）

［Abstract］Objective：ToimprovethetechnigueforextractingRNAfromformaiin-fixedandparaffin-embeddedtissue.Methods：Sampiesof100casesthatdiagnosedpathoiogicaiiywerecoiiected.Aftersomepretreatmentsuchasdeparaffinage，washing，digestion，totaiRNAwereextractedfromthesetis-sueswithTRIZOLreagentand，then，keptat-20Cforiongtime（above2h）tosettieRNA.ThepurenessandcontentoftheseRNAextractswereassayedwithanucieicaciddetectinginstrumentandtheguaiityoftheextractswastestedwithdetectingofgene!-actinwithRT-PCR.Results：Thecon-centrationofRNAintheextractswerebetween20~50mmoi/L.Theratioof260nm/280nmwerebe-Thereasonabiepre-tween1.75~2.00.TheRNAof!-actinweredetectedinaiicases.Conclusions：

treatmentadoptedinthisstudymakesitfeasibietoextractRNAfromformaiin-fixedandparaffin-em-beddedtissueandtodetectgenesspecifictosomediseasesindaiiypathoiogicaidiagnosis.

［Keywords］RNA，neopiasm；paraffinembedding；reversetranscriptasepoiymerasechainreaction来 在实际临床病理诊断和病理回顾性研究中，

源最丰富、最容易获得的是经过石蜡包埋保存的档案组织。与DNA相比较，RNA很不稳定，容易受到环境温度、酸碱度等因素的影响，尤其是无处不在的RNA酶对它的降解破坏，使得长期以来，对RNA的研究材料都仅限于培养细胞或新鲜组织，至少是冰冻组织，影响了对它的研究应用。以石蜡包埋组织为研究材料，在文献报道的基础上，对石蜡组织RNA的提取方法进行改进和完善，拟建立一套在石蜡包埋组织中提取RNA的有效方法。

1 材料和方法

1.1 材料 收集贵阳医学院附属医院病理科1990年6月~2003年10月临床病理诊断的淋巴结非霍

淋巴结反应性增生20例，胃奇金淋巴瘤病例30例，

癌20例，肠癌20例，桥本甲状腺炎10例。1.2 试剂 DEPC（Sigma公司）、TRIZOL试剂（In-vitrogen公司）、MMLV逆转录酶（NEB及MBI公

DNA聚合酶（TAKARA公司）、dNTP（上海博司）、雅公司）、蛋白酶K（MBI公司）和琼脂糖（SPAN-241

贵阳医学院学报

ISH公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）、硼酸、十二烷基硫酸钠（SDS）及乙二胺四乙酸二钠（EDTA）购自上海华舜生物工程有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇及二甲苯均购自成都新川化学试剂公司。1.3 方法

1.3.1 实验用品RNA酶的灭活 玻璃器皿（量筒、烧杯、试剂瓶、玻片等）常规清洗浸泡后，用锡

塑料用箔纸密封瓶口，置于180C烤箱中烘烤81；

品（tip头、tip头盒、离心管、PCR管等）置于0.1%的DEPC溶液中浸泡121后高压消毒（121C，22

30卷

1.3.3.2 RT-PCR 以看家基因\"-actin作内对照，RT-PCR扩增其190bp的片段。引物序列为TGGAGAAATCTGGCACCAC（正义链），GAGGCG

（反义链）。RT-PCR采用两TACAGGGATAGCAC

步法，经MMLV逆转录酶逆转录后，进行PCR扩增。扩增条件：95C2min预变性，94C30s，55C30s，72C45s，循环30次。取RT-PCR产物进行2%琼脂糖电泳，之后置于溴化乙锭溶液（0.5mg/L）中染色30min，紫外透射灯下进行观察。

min）

，烤干备用。1.3.2 RNA提取 （1）切片：切片机用75%乙醇充分擦净，之后用0.1%的DEPC充分清洗。用0.1%的DEPC擦拭的一次性刀片切5!m厚石蜡切片5~10张（根据组织大小调整），置于经RNA酶灭活处理的1.5mI离心管中。肿瘤组织需将切片裱于RNA酶灭活处理的玻片上，经HE切片观

察定位后，再刮取肿瘤区域装管；（2）

脱蜡：加入1.2mI二甲苯，室温离心，8600r/min，10min，离心3次。若脱蜡仍不理想则将EP管置于37C孵箱15~20min，再以上述转速离心8min。（3）清洗：加入无水乙醇1.2mI，室温离心，8600r/min，10min，离心3次。（4）干燥：弃出管中酒精，开盖，置

于37C孵箱，

20min。（5）消化：加入组织裂解缓冲液（20mmOI/LTris，pH8.0；20mmOI/LEDTA，pH8.0；2%SDS，pH7.2）200~250!I，混匀，加入蛋

白酶K

（终浓度400mg/L），置于58C烤箱或水浴振荡摇床进行组织消化至液体清亮。消化时间根据组织类型而定；（6）灭活蛋白酶K：将消化后的组织置于95C水浴锅，水浴10min；（7）加入TR-IZOL试剂，混匀，室温孵育10min；（8）加入氯仿200!I，用力震荡后静置3min，4C，13000r/min离心15min；（9）吸取上层水相，加入等体积异丙

醇，混匀，置于-20C沉淀RNA，

21。4C，13000r/min离心15min；（10）弃上清，加入1.2mI75%的

酒精（0.1%DEPC处理水配制）

，离心，4C，11000r/min，10min；（11）弃上清，倒置悬空离心管，干燥8min；（12）加入0.1%的DEPC处理水，58C，10min，以溶解RNA。对上述方法提取的RNA质量不理想者，进行从步骤（5）~（12）的二次提取，每步根据具体情况酌情缩短时间。合格的RNA保存于-85C超低温冰箱备用。1.3.3 RNA的质量检测

1.3.3.1 核酸测定仪测定 取4!IRNA，用0.5倍TBE缓冲液稀释100倍，测定RNA浓度、260nm及280nm光密度比。242

2 结果

2.1 核酸测定仪测定结果 100例石蜡包埋组织中提取的RNA经过核酸测定仪测定后，85例浓度在20~50mmOI/L，260nm及280nm光密度比在1.75以上；剩余的15例（均为胃或肠癌组织）浓度在85mmOI/L以上，260nm及280nm光密度比在1.45~1.。在11水浴振荡摇床加强消化后，经过二次提取，均达到上述合格的RNA质量要求。2.2 经过RT-PCR反应，提取的RNA都能扩增出190bp的\"-actin目的片段（图1）。

M：Marker；1~2：淋巴瘤；3~4：胃癌；5：反应性增生淋巴结；6：肠癌；7：桥本氏甲状腺炎

图1 石蜡包埋组织中提取的RNA

Fig.1 RNAisOIatedfrOmparaffin-embbedtissue

3 讨论

目前，肿瘤和非肿瘤性疾病的分子遗传学改变在诊断中具有重要作用，尤其是一些软组织和淋巴造血组织肿瘤的特殊分子遗传学改变及其产生的

影响在临床病理诊断中显得至关重要［1~3］

。这些客观的检查需要高质量的目的DNA和RNA，而在病理诊断中，我们面对的常常是固定、石蜡包埋的组织标本，对石蜡组织RNA的提取，国外

和国内报道都不多［4~6］

。RNA提取的方法有很多种，较多的是利用胍类物质提取，目前推出的柱层

3期孟 青等 石蜡包埋组织中RNA提取方法的改进和完善

检测片段的!-actin，这样方能保证检测目的基因所需的RNA质量。本实验表明，通过RNA提取前对材料的一系列合理处理，从固定、石蜡包埋档案组织材料中提取小片段RNA进行目的基因mRNA检测可以成为一种稳定成熟的方法应用于临床。目前，为了准确获取研究对象，激光显微切割

正在逐渐推广。完善的RNA提取方法技术（LMS）

加上精确的定位，将使RNA的研究材料得以广泛拓宽，更符合临床病理研究所需。

析法也是省时简便的方法。对于固定、石

蜡包埋档案组织材料，组织中的RNA在前期的固定包埋中已受到不同程度的破坏，这一不可避免的事实使我们只能从中获得大小不等的RNA片段，虽然柱层析法简便易行，但小段片的RNA容易丢失。我们选用了TRIZOL试剂，其主要成分为异硫氰酸胍，作为强烈的蛋白变性剂，溶解蛋白，使细胞

防止RNA结构破坏，同时能有效地抑制RNA酶，

的再降解。在提取前充分的脱蜡和清洗是必不可少的，没有彻底的脱腊后续的组织消化效果将会受到明显的影响，故一些较大的组织块在离心之后再辅以加热脱蜡。在以往文献报道中，组织消化时使

这种浓度消用的蛋白酶K浓度在l00mg/L以下，

化往往需要过夜，使提取周期较长，容易产生不必

费时费力，而且不便观察消化效要的RNA酶污染，

［4，6］果。为了减少内源性RNA酶的破坏作用，同时也保证理想的消化效果，我们对细胞裂解液的成分和酸碱度进行较为准确的控制，并摸索出一套高浓度短时间的蛋白酶K消化方法。消化组织不过夜，根据组织类型决定消化时间和方法。通过摸索发现对于胃和肠癌组织的消化，需将干热和水浴振荡消化相结合，适当延长消化时间，必要时在第一次提取后进行二次消化。相对而言，淋巴结和甲状腺组织较容易消化，一般一次消化即可。在RNA提取中，通过配合长时间的低温沉淀（较以往报道延长l倍）和离心，减少RNA的破坏，保证小片段RNA充分沉淀下来，提高RNA产量。对于肿瘤组织，由于组织材料中成分复杂，为保证选取组织的准确性，避免不必要的误差，对组织作HE切片观察，进行了粗略定位，以选取研究所需病变。这对于准确获取所需要的肿瘤组织RNA是一个非常重要环节。如果有条件进行病变的准确定位，将会更有利于提高获取研究材料的准确性。关于RNA的质量，通过核酸测定仪测定，提取的RNA纯度A260/A280在l.75~2.00。内对照选择明显大于

4 参考文献

［l］LiuH，YeH，DoganA，etal.T（ll，l8）（g2l，g2l）isas-sociatedwithadvancedmucosa-associatedlymphoidtissuelymphomathatexpressesnuclearBcll0［J］.Blood，200l，98（4）：ll82-ll87.

［2］HuangX，ZhangZ，LiuH，etal.T（ll；l8）（g2l；g2l）

ingastricMALTlymphomaanddiffuselargeB-celllym-phomaofChinesepatients［J］.HematolJ，2003，4（5）：342-345.

［3］WillsTG.JadayelDM，DuMO，etal.Bcll0isinvolved

in（tl；l4）（p22；g32）ofMALTB-celllymphomaandmutatedinmutipletumortypes［J］.Cell，l999，96：35-45.

［4］TsujiS，HisaokaM，MonrimitsuY，etal.DetectionofSYS-SSXfussiontranscriptioninsynovialsarcomabyreversetranscriptiontranscription-polymerasechainreactionusingarchivalparaffin-emdeddedtissue［J］.AmJPazholl998，l53（6）：l807-l8l2.

［5］InagakiH，OkabeM，SetoM，etal.API2-MALTlfusion

transcriptsinvolvedinmucosa-associatedlymphoidtissuelymphoma：multiplexRT-PCRdetectionusingformalin-fixedparaffin-embeddedspecimens［J］.AmJPathol，200l，l58（2）：699-706.

［6］魏永昆，孙孟红，朱红光，等.滑膜肉瘤石蜡包埋组织

SYT-SSX融合基因检测的临床病理意义［J］.中华病理杂志，200l，30（6）：426-430.

（2004-09-2l收稿，2004-l2-20修回）

（上接第240页）

脑损害，改善脑细胞功能，从而减轻神经系统后遗

症，具有明显的脑保护作用。

lowingfocalischemia［J］.BrainRes，l993，623：7.［2］王维治.神经病学［M］.第四版.北京：人民卫生出版

社，200l.l30-l42

［3］刘学伍，迟兆富，尚伟，等.癫痫持续状态血与脑脊液神

经元特异性烯醇化酶含量的变化及Mg2+的脑保护作用［J］.中风与神经疾病杂志，2003，20（2）：78-8l.

（2004-ll-l6收稿）

4 参考文献

［l］BaroneFc，ClarjRK，PriceWJ，etal.Neuronspecific

enolaseincreaseincerebralandsystemiccirculationfol-

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石蜡包埋组织中RNA提取方法的改进和完善

作者：

作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

孟青， 杨文秀， 胡军， 高勤， MENG Qing， YANG Wen-xiu， HU Jun， Gao Qin贵阳医学院,病理学教研室,贵州,贵阳,550004贵阳医学院学报

JOURNAL OF GUIYANG MEDICAL COLLEGE2005,30(3)2次

1.魏永昆;孙孟红;朱红光 滑膜肉瘤石蜡包埋组织SYT-SSX融合基因检测的临床病理意义[期刊论文]-中华病理杂志 2001(06)

2.Inagaki H;Okabe M;Seto M API2-MALT1 fusion transcripts involved in mucosa-associated lymphoidtissue lymphoma:multiplex RT-PCR detection using formalin-fixed paraffin-embedded specimens2001(02)

3.Tsuji S;Hisaoka M;Monrimitsu Y Detection of SYS-SSX fussion transcription in synovial sarcoma byreverse transcription transcription-polymerase chain reaction using archival paraffin-emdeddedtissue 1998(06)

4.Wills TG;Jadayel DM;Du MQ Bcl 10 is involved in t(1;14)(p22;q32 ) of MALT B-cell lymphoma andmutated in mutiple tumor types[外文期刊] 1999

5.Huang X;Zhang Z;Liu H T(11;18)(q21;q21) in gastric MALT lymphoma and diffuse large B-celllymphoma of Chinese patients 2003(05)

6.LIU H;Ye H;Dogan A T(11,18)(q21,q21) is associated with advanced mucosa-associated lymphoidtissue lymphoma that expresses nuclear Bcl 10 2001(04)

1. 齐妍.常彬.李洪安.王国亮.蒋金芳.梁伟华.李锋.QI Yan.CHANG Bin.LI Hong-an.WANG Guo-liang.JIANGJin-fang.LIANG Wei-hua.LI Feng 一种简便的从石蜡包埋组织中提取RNA的方法[期刊论文]-生物技术通讯2007,18(1)

2. 孙冰.郭晓红.江泽飞.张峰.吴世凯.张利利.王敦梅.宋三泰.SUN Bing.GUO Xiao-hong.JIANG Ze-fei.ZHANGFeng.WU Shi-kai.ZHANG Li-li.WANG Dun-mei.SONG San-tai 乳腺癌冰冻和石蜡包埋样本的RNA以及基因表达情况的比较研究[期刊论文]-临床肿瘤学杂志2010,15(7)

3. 马晓丽.黄淑红.汪运山.谢经武.张红卫 病理组织中提取RNA的方法学研究[期刊论文]-山东大学学报（医学版）2004,42(5)

4. 赵志龙.宗志红.李建新.刘宏旭.赵惠儒.ZHAO Zhilong.ZONG Zhihong.LI Jianxan.LIU Hongxu.ZHAO Huiru 从石蜡包埋肺癌组织提取RNA检测PML基因转录的研究[期刊论文]-中国肺癌杂志2008,11(4)

5. 曹慧仁.张元鑫.张红卫 从石蜡包埋组织高效提取RNA的优化及Shh的RT-PCR检测[期刊论文]-山东大学学报(理学版)2004,39(4)

6. 程万宏.王艳俊.隗玉川 石蜡包埋组织中提取RNA的方法改良[期刊论文]-中国中医药咨讯2010,02(7)7. 陈柳青.曾学思.孙建方.Chen Liuqing.Zeng Xuesi.Sun Jianfang 石蜡包埋皮肤组织标本中提取RNA进行逆转录PCR的研究[期刊论文]-中国麻风皮肤病杂志2006,22(1)

8. 吕杨.陈香美.尹忠.张雪光.王兆霞.冯哲.洪权.师锁柱 三种不同方法固定的石蜡切片中RNA的分析[期刊论文]-中国生物化学与分子生物学报2004,20(2)

9. 改良一步法从甲醛固定-石蜡包埋组织中提取RNA[期刊论文]-中华医学杂志2000,80　(5)

10. 章容.王洪 从固定-石蜡包埋淋巴组织抽提RNA的影响因素研究[期刊论文]-第三军医大学学报2004,26(2)

1.杨开颜.金珍琳.俞康.王素芬 p73基因在反应性增生性淋巴结炎及滤泡性淋巴瘤中的表达[期刊论文]-癌变·畸变·突变 2010(2)

2.金珍琳.俞康.杨开颜.黄卡特 p63在Castleman病及滤泡性淋巴瘤中的表达[期刊论文]-温州医学院学报2009(3)

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