维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７，２３（９） 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ８９９ 文章编号：１００２—２６９４（２００７）０９—０８９９—０４ 禽流感病毒ＮＰ基因的酵母双杂交饵 载体表达及自激活检测＊ 柳 斌 ，李文平 ，屈孝初 ，唐宇龙 ，张传福 ，周晓巍 ，黄培堂 摘 要：目的 构建Ｈ５ＮＩ亚型禽流感病毒ＮＰ基因的酵母双杂交诱饵载体，验证其在酵母中的表达并检测其自激活作 用。方法 以ＰＣＲ法从ｐＧＥＭＴ／Ｈ５ＮＰ扩增ＮＰ基因编码区序列，将其定向克隆到ＰＧＢＫＴ７载体，经测序鉴定后，ＰＥＧ／Ｌｉ— Ａｃ法转化酵母菌株ＡＨ１０９，用表型筛选法及颜色筛选法检测其自激活作用同时Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ验证诱饵蛋白的表达。结果 获得ＮＰ编码区基因，并成功构建酵母双杂交系统中的诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＮＰ，对宿主细胞酵母菌株ＡＨ１０９无毒性和自激活 作用，并能在酵母细胞中稳定表达。结论 诱饵载体ｐＧＢＫＴ７一ＮＰ可用于ＧＡＬ４酵母双杂交系统钓取与禽流感病毒核蛋白相 互作用的蛋白。 关键词：ＮＰ基因；诱饵载体；酵母双杂交；自激活作用 中图分类号：Ｒ３７３．１ 文献标识码：Ａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｂａｉｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ—ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ＬＩＵ Ｂｉｎ，ＬＩ Ｗｅｎ－ｐｉｎｇ，ＱＵ Ｘｉａｏ－ｃｈｕ，ＴＡＮＧ Ｙｕ—ｌｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｃｈｕａｎ—ｆｕ，ＺＨＯＵ Ｘｉａｏ－ｗｅｉ，ＨＵＡＮＧ Ｐｅｉ—ｔａｎｇ （Ｉｎｓｔｉｔｕｄｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＢｅｉＪ ｉｎｇ １０００７ １，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＰ）ｏｆ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ（Ｈ５Ｎ １）ｉｎ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｔＯ ｄｅｔｅｃｔ ｉｔｓ ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｙｓｔｅｍ．ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｏｆ ＮＰ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＧＥＭＴ／Ｈ５ＮＰ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐＧＢＫＴ７ ｖｅｃｔｏｒ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔＯ ｔｈｅ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ．Ｔｈｅ ｂａｉｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎ ＡＨ１０９ ｂｙ ＰＥＧ／ＬｉＡｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｌｏｒ ａｓｓａｙ，ｔｈｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇａｌ４一ＮＰ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｗａｙ，ｔｈｅ ｂａｉｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ＮＰ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｗｅｒｅ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｌｉｎｇ．Ｔｈｅ ｂａｉｔ ｖｅｃｔｏｒ ＰＧＢＫＴ７一ＮＰ ｗａｓ ｎｏｎｔｏｘｉｃ ｔＯ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｄｉｄ ｎｏｔ ｈａｖｅ ｓｅｌｆ－ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ＧＡＬ４ ｓｙｓｔｅｍ ３ ｃａｎ ｂｅ ｕｔｉｌｉｚｅｄ ｔＯ ｆｉｓｈ ＮＰ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｇｅｎｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＰ）；ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ；ｂａｉｔ ｖｅｃｔｏｒ；ｙｅａｓｔ ｔＷＯ—ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ；ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｐｏｒｔ— ｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ 高致病性禽流感病毒（ｈｉｇｈｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ａｖｉａｎ 个的ＲＮＡ片段，其第５片段为核蛋白（Ｎｕｃｌｅｏ— ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ，ＨＰＡＩＶ）属Ａ型流感病毒，主要引 ｐｒｏｔｅｉｎ）基因。禽流感病毒血清学亚型众多，病毒 起禽类以呼吸系统疾病、产蛋下降乃至急性致死和 变异极为频繁，但变异主要集中在病毒的血凝素 高死亡率等为特征的烈性传染病，常给养禽业造成 （ＨＡ）和神经氨酸酶（ＮＡ）２种表面结构蛋白上，而 毁灭性打击。ＡＩＶ亚型众多，极易发生基因突变和 核蛋白（ＮＰ）则具有种群和型特异性，能产生具有交 重排，给禽流感的免疫和诊断带来极大的困难ｎ 。 叉保护作用的抗体和细胞免疫反应 。与ＨＡ和 ＨＰＡＩ作为目前人类所面临的共同挑战，受到国内 神经氨酸酶相比，ＮＰ的稳定性更高，在固定毒株和 外研究者的重视，已经在其流行病学特点、遗传变异 野毒株之间变异较小 。ＮＰ与病毒的ＲＮＡ及多 和致病性等方面已经做了大量的工作，证明病毒宿 聚酶共同装配成ＲＮＰ复合体，通过ＮＰ与ＲＮＡ、其 主特异性的改变和毒力的变化都与病毒抗原的变异 ＊国家科技支持计划资助项目（２００６ＢＡＤ０６Ａ０１） 有关；而ＨＰＡＩ病毒多次有效地突破人群的免疫屏 通讯作者：周晓巍，Ｅｍａｉｌ：ａｍｍｓ８３２＠１２６．ｃｏｒｎ 障，则与病毒同宿主细胞相互作用有很大关系 。 作者单位：１．军事医学科学院生物工程研究所，北京１０００７１； ＡＩＶ的基因组为单股负链ＲＮＡ，含有大小不同的８ ２．湖南农业大学动物科技学院，长沙４１０１２８ 维普资讯 http://www.cqvip.com ９００ 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 它病毒蛋白成分及感染细胞上某些大分子之间的相 互作用，影响病毒的转录、复制、装配及转运功能，而 病毒的复制与转录直接关系到对宿主的侵害，是病 毒感染与致病的重要因素。病毒感染宿主后通过多 种信号传导途径引起病毒与宿主细胞基因和蛋白表 达的变化，同时这种表达谱的变化也呈现在时间和 空间上，而且这些变化构成了病毒复制、感染、致病 和免疫的分子基础。然而，现在对流感病毒一宿主细 胞相互作用关系，尤其是在蛋白质水平上的相互作 用关系尚缺乏系统的研究，对有关ＮＰ基因确切功 能及其机制尚未阐明。基因的功能最终决定于它所 编码的蛋白以及蛋白之间的相互作用，以真核细胞 转录机制为基础的酵母双杂交系统是研究蛋白之间 相互作用的有力手段。 。有鉴于此，本实验扩增了 ＮＰ编码区基因，并应用定向克隆技术，构建了含 ＮＰ编码区的ｐＧＢＫＴ７诱饵载体，验证其在酵母中 的表达并检测其自激活作用，拟采用酵母双杂交技 术从正常人胚肺ｃＤＮＡ文库中筛选与ＮＰ直接相互 作用的蛋白，并查明他们的相互作用位点及其体内 外结合特性，为进一步为对ＮＰ蛋白功能的深人研 究，以及对流感病毒一宿主细胞相互作用关系，尤其 是在蛋白质水平上的相互作用关系的研究打下 基础。 １材料与方法 １．１载体，受体菌，及酵母双杂交系统克隆有基 因全长ｃＤＮＡ的质粒ｐＧＥＭＴ／Ｈ５ＮＰ，转化用大肠 杆菌ＤＨ５ａ由本室保存。酵母双杂交系统试剂盒 （ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ—ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ３）购自 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司，其中包括酵母菌株ＡＨ１０９，ＢＤ （ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）诱饵质粒ｐＧＢＫＴ７，阳性对照质 粒ｐＣＬ１，阴性对照质粒ｐＧＢＫＴ７一Ｌａｍ以及ＡＤ（ａｃ— ｔｉｖｅ ｄｏｍａｉｎ）质粒ｐＧＡＤＴ７一ＲｅｃＴ。 １．２主要试剂Ｘ－ａ－Ｇａｌ购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司；所有 氨基酸和酵母培养基购自Ｓｉｇｍａ公司。高保真 ＤＮＡ聚合酶，ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ购自美国法特捷公 司，ＤＮＡ分子量ＭａｒｋｅｒｌＩＩ，琼脂糖胶回收试剂盒购 自北京天为时代公司；ＤＮＡ重组所用各种性内 切酶ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，Ｔ４连接酶购自Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ— ｏｌａｂｓ公司，质粒快速提取试剂盒购自ＯＭＥＧＡ公 司，Ｃ－Ｍｙｃ抗体（９Ｅｌ０）购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ＨＲＰ 标记的二抗以及ＥＣＬ发光系统购自Ａｍｅｒｓｈａｍ公 司；其它常用试剂为国产分析纯，由军事医学科学院 蛋白质工程实验室保存。 １．３ ＰＣＲ引物设计与合成 参照已发表在Ｇｅｎ～ Ｂａｎｋ上的Ｈ５ＮＩ亚型禽流感病毒核蛋白基因序列， 同时为了在酵母细胞中融合表达Ｇａｌ４一ＤＮＡ—ＢＤ－ ＮＰ蛋白，应用Ｂｉｏｅｄｉｔ设计软件，在ＮＰ基因的编码 区设计并合成１对引物：上游引物（Ｐ１）：５ ＣＧＡＡＴ— ＴＣＴＡＡＴＧＧＣＧＴＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＡ ３ 和下 游引物（Ｐ２）：５ ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＧＴ— ＣＡＴＡＣＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＴＧＴ３ 。上游引物（Ｐ１）， 含有起始密码子ＡＴＧ，加人了ＥｃｏＲＩ酶切位点及相 应的保护碱基；下游引物（Ｐ２），含有终止密码子 ＴＡＡ，并加人ＳａｌＩ酶切位点及相应的保护碱基，引 物由上海英骏生物工程公司合成。 １．４ ＮＰ编码区基因的扩增 以质粒ｐＧＥＭＴ／ Ｈ５ＮＰ为模板（每２Ｏ Ｌ体系加质粒０．２ Ｌ），按试 剂盒说明依次加人１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２ｕＬ、１０×ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ ２ｇＬ、特异上下游引物Ｐ１，Ｐ２各０．４ｇＬ、高 保真聚合酶０．２ｔＬＬ，混匀后补灭菌蒸馏水至２Ｏ Ｌ， 置于扩增仪扩增。循环参数：９５℃预变性５ｍｉｎ， ９４℃变性３０ｓ，５６℃退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，２５个 循环，最后７２℃延伸反应７ｍｉｎ。取ＰＣＲ产物 １０ｔｌＬ用１ 琼脂糖凝胶进行电泳，检查扩增结果。 １．５ ｐＧＢＫＴ７一Ｈ５ＮＰ诱饵载体的构建与鉴定将 上述ＰＣＲ产物和空的酵母表达载体ｐＧＢＫＴ７分别 用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切，用ＤＮＡ胶回收试剂盒回 收定量，于１６℃水浴连接１２ｈ，转化大肠杆菌 ＤＨ５ａ，利用抗生素标记（Ｋａｎ＋）筛选阳性克隆。用 ＯＭＥＧＡ质粒提取试剂盒提取质粒ＤＮＡ，分别进行 酶切及测序鉴定。 １．６ ｐＧＢＫＴ７一Ｈ５ＮＰ转化ＡＨ１０９酵母细胞 １．６．１ 酵母感受态细胞的制备 挑取ＡＨ１０９酵 母菌３～４个克隆，接种于ＳＤ－Ｕｒａ的液体培养基 中，于３Ｏ℃以２５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养ｌ６～１８ｈ至Ａ６。。 ≥１．５。将上述新鲜培养液接种于３００ｍＬ ＹＰＤＡ培 养基中，稀释至Ａ 。。 一０．２～０．３，再于３Ｏ℃以 ２５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养至Ａ６。。 ＝０．４～０．６，在室温下 离心（４ ０００ｒ／ｍｉｎ）５ｍｉｎ。弃上清，加２５～５０ｍＬ预 冷去离子水重悬沉淀，洗涤酵母细胞．再离心、取沉 淀，用１．５ｍｌ １×ＴＥ／ＬｉＡｃ重悬，即为酵母感受态 细胞。 １．６．２酵母感受态细胞的转化及诱饵蛋白对酵母 宿主菌毒性检测 在每个１．５ｍＬ微量离心管中， 加人已构建好的诱饵载体０．１ｇ。同时设置阳性、阴 性对照质粒，再分别加人ｈｅｒｒｉｎｇ ｔｅｓｔｅｓ ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ０．１ｍｇ及１００ｔ￣Ｌ上述制备的酵母感受态细胞， 最后加０．６ｍｌ ＰＥＧ／ＬｉＡｃ溶液．经Ｖｏｒｔｅｘ振荡混匀 后，于３Ｏ℃经２００ｒ／ｒａｉｎ振荡培养３０ｍｉｎ，每管加人 ７Ｏ Ｌ ＤＭＳＯ，轻轻混匀，于４２℃热休克１５ｍｉｎ，冰浴 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com ９０６ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 中国人兽共患病学报 ２００７，２３（９） 分子质量与文献符合㈤。ＭＢＰ—ｒＬｐｐ２０经Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ酶切，最终产生了相对分子质量分别为４ｌ×ｌ０ 和ｌ５×ｌ０。的两种片段，前者的分子质量与ＭＢＰ符 合，而后者比预期酶切产物的分子质量小约３× ｌ０。。结合ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析的结 果，可以推断此ｌ５×ｌ０。片段即为ｒＬｐｐ２０片段，其 分子量小于预期的原因可能是在酶切过程中，在 ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉｃ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｇｌａｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｎｇｏｌｉａｎ ｇｅｒｂｉｌｓＣＪ３．Ｈｅｌｉｃｏ— ｂａｃｔｅｒ，２００５，１０：９７－１０６． Ｃ３３ Ｈａｍａｇｕｃｈｉ Ｋ，Ｏｇａｗａ Ｋ，Ｋａｔｓｕｂｅ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｄｏｅｓ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄ— ｕａｌ ｓｔｏｍａｃｈ ａｆｔｅｒ ｇａｓｔｒｅｃｔｏｍｙ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ？Ｃｏｍｐａｒｉ— ｓｏｎ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｓｔｏｍａｃｈ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋｓ Ａｒｃｈ Ｓｕｒｇ， ２００４，３８９：８３—９１． Ｃ４３ Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ Ｔ，Ｓｃｈｍｉｔｔ Ａ，Ｗａｌｄｕｃｋ ＡＫ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ＰＹ— ｒＬｐｐ２０多肽链的Ｃ末端有３×１０。的小片段被降 ｌｏｒｉ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｆａｃｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅＣＪ３．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉ— 解。应用生物信息学软件Ｏｍｉｇａ ２．０在ＭＢＰ— ｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，２９５：３４３—３５３． ｒＬｐｐ２０分子的氨基酸序列中未能发现预期之外的 Ｃ５３ Ｆｅｒｒｅｒｏ ＲＬ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｉｔ．ｐｙｌｏｒｉ：ａｎ ａｃｈｉｅｖａｂｌｅ ｇｏａｌ 酶切位点。通过改变酶切温度和时间也未能消除此 ＣＪ３．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ，２００３，２７：４８８—４９３． Ｃ６３ Ｋｅｅｎａｎ Ｊ，Ｏｌｉａｒｏ Ｊ，Ｄｏｍｉｇａｎ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎ 小片段的降解，该现象尚待深入研究。 １８一ｋｉｌｏｄａｈｏｎ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ２０ ａｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析显示，纯化的ＭＢＰ—ｒＬｐｐ２０ ｌｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， 和ｒＬｐｐ２０均能与相应的免疫鼠血清发生阳性反 ２０００，６８：３３３７—３３４３． 应，表明采用该表达系统和纯化方法制备的重组蛋 Ｃ７３Ｋｏｓｔｒｚｙｎｓｋａ Ｍ，ＯＴｏｏｌｅ ＰＷ，Ｔａｙｌｏｒ ＤＥ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒ— 白ＭＢＰ—ｒＬｐｐ２０和ｒＬｐｐ２０具有免疫原性。ＭＢＰ－ ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ２０一ｋｉｌｏｄａｈｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ［Ｊ］．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９４， ｒＬｐｐ２０和ｒＬｐｐ２０与小鼠抗Ｈｐ菌体抗原血清的阳 Ｉ７６：５９３８—５９４８． 性反应表明，这两种重组蛋白保持了Ｈｐ天然蛋白 Ｃ８３张荣光，段广才，范清堂．幽门螺杆菌脂蛋白基因的克隆和生物 的抗原活性。研究结果提示这两种重组蛋白，特别 信息学分析［Ｊ］．中国人兽共患病学报，２００６。２２（２）：】１３５—１１３８． 是ｒＬｐｐ２０，有希望成为新的Ｈｐ疫苗候选抗原。此 ［９３Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．分子克隆实验指南［Ｍ］．３ 版．北京：科学出版社，２００５，１２１７－１２６５． 外，有报道表明，对人体内Ｈｐ Ｌｐｐ２０蛋白的检测结 Ｃ１０３ Ｈｏｃｋｉｎｇ Ｄ，Ｗｅｂｂ Ｅ，Ｒａｄｃｌｉｆｆ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ 果与Ｈｐ感染、胃癌以及胃癌高发人群都具有很大 ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ａｎｔｉｇｅｎｓ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， 相关性ｎ ，因此，ｒＬｐｐ２０对这些疾病的免疫诊断 １９９９，６７：４７１３－４７１９． 可能也具有应用价值。 ［１１３ Ｓｈｉｅｓｈ ＳＣ，Ｓｈｅｕ ＢＳ，Ｙａｎｇ ＨＢ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｌｏｗｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｗｅｉｇｈｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｓ ｒｅｌａｔ— 参考文献： ｅｄ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ Ｃ１３Ｍａｈｌｅｒ Ｍ，Ｈｅｉｄｔｍａｎｎ Ｗ，Ｎｉｅｗｉｅｓｋ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅ— ［Ｊ］．Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ，２０００，４５：７８１—７８８． ｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎｔｒａｌ—ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ，ｃｈｒｏｎｉｃ ［１２３ Ｋｏｎｔｕｒｅｋ ＰＣ，Ｋｏｎｔｕｒｅｋ ＳＪ，Ｓｔａｒｚｙｓｋａ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｖｅ ｇａｓｔｒｉｔｉｓ ｉｎ ｈｉｓｐｉｄ ｃｏｔｔｏｎ ｒａｔｓ（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）ＣＪ］． ｐｙｌｏｒｉ—ｇａｓｔｒｉｎ ｌｉｎｋ ｉｎ ＭＡＬＴ ｌｙｍｐｈｏｍａＣＪ３．Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ，２００５，１０：３３２－３４４． Ｔｈｅｒ，２０００，１４：１３１Ｉ－Ｉ３１８． ［２］Ｔａｔｅｍａｔｓｕ Ｍ，Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ Ｔ，Ｍｉｚｏｓｈｉｔａ Ｔ．Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ 收稿日期：２００６－１１－２４；修回日期：２００７－０４－１７ ｐｙｌｏｒｉ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒｓ ａｎｄ （上接第９０２页） ［１ １３ ＹａｎｇＭ，ＷｕＺ，Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ—ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎａｌｙｚｅｄ Ｃ７３ Ｋｏｄｉｈａｌｌｉ Ｓ．Ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍＣＪ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９５， ｆｏｒ ｔｕｒｋｅｙ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２３（７）：１１５２—１１５６． ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９４，１２（１５）：１４６７—１４７２． Ｃ１２３ Ａｖａｌｏｓ，Ｚ Ｙｕ，Ｄ Ｐ Ｎａｙａｋ，ｅｔ ａ１．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ｃ８３ Ｅｐｓｔｅｉｎ ＳＬ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ＮＰ ａｎｄ Ｍ１ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｉｎｆｌｕ— ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｖｉｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓＣＪ］．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉ—ｉｎｆｅｃｔ Ｔｈｅｒ，２００３，Ｉ ｅｎｚａ ｖＩｒｕｓ—ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｉｌｓ．［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ，１９９７，７Ｉ：２９４７－２９５８． （４）：８９—１００． ［１３３Ｍａｒｉｏｎ，Ｒ，Ｍ，Ｚｕｒｃｈｅｒ，Ｓ．ｄｅ ｌｌｆ Ｌｕｎａ，ｅｔ ｆｌ１．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ｃ９３Ｃｈｉｅｎ ＣＴ，Ｂａｒｔｅｌ ＰＬ，Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓ— ＮＳ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ 。ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｒｎ 。 ｔａｍ：Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎｄ ｃｌｏｎｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｉｎ— ｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．［Ｊ］．Ｇａｎ Ｖｉｒｏｌ，１９９７，７８：２４４７—２４５１． ｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｆｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ ＣＪ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， Ｃ１４３Ｓｉｄｈａｒｔｈａ Ｋ，Ｂｉｓｗａｓ，Ｐａｕｌ Ｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎ— １９９１。８８：９５７８—９５８２． ｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ［１０］Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ，Ｓｏｎｇ Ｏ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ—ｐｒｏ— １９９８，８：５４９３－５５０１． ｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４０（２ ０）：２４５－２４６． 收稿日期：２００６－１０－２１；修回日期：２００７—０３—２８
