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过敏原Der p 23 重组蛋白制备及其特异性IgE 化学发光检测方法的建立

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周摇鹰等摇过敏原Derp23重组蛋白制备及其特异性IgE化学发光检测方法的建立摇第20期·2491·

doi:10.3969/j.issn.1000鄄484X.2020.20.012

·免疫学技术与方法·

过敏原Derp23重组蛋白制备及其特异性IgE化学发光检测方法的建立淤

周摇鹰摇吴美丽摇朱晗婷于摇崔玉宝于盂摇(南京医科大学附属无锡市儿童医院儿科实验室,无锡214023)

摇摇中图分类号摇R384郾4摇摇文献标志码摇A摇摇文章编号摇1000鄄484X(2020)20鄄2491鄄04

[摘摇要]摇目的:制备过敏原Derp23重组蛋白并建立其特异性IgE化学发光免疫检测方法。方法:以屋尘螨TotalRNA为模板,依据GenBank公布的序列(No郾EU414751)设计并合成引物,RT鄄PCR扩增Derp23编码基因,构建原核表达质粒pET28a(+)鄄Derp23,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,柱层析纯化收集目的蛋白并采用SDS鄄PAGE、Westernblot鉴定。以此重纯化后的重组蛋白经SDS鄄PAGE和Westernblot鉴定可见单一条带,定量分析呈现0郾5ml、0郾25mg/ml、纯度>95%的重组蛋白纯化成功。以该重组蛋白建立化学发光方法检测屋尘螨过敏性哮喘或/和过敏性鼻炎患者血清,阳性率为郾8%,以国际金标准ImmunoCAP方法同步检测Derp23单组分特异IgE阳性率为95郾92%,两种方法检测结果差异无统计学意义(字2=0郾237,P=0郾626)。结论:获得了屋尘螨过敏原重组蛋白Derp23,成功建立了其化学发光免疫检测方法,为过敏原单组分分辨诊断方法建立提供了技术平台。

[关键词]摇重组过敏原;化学发光免疫分析法;屋尘螨;组分分辨诊断

组蛋白包被化学发光板,建立化学发光免疫分析法检测经ImmunoCAP检测的过敏性鼻炎或/和过敏性哮喘患者血清。结果:

PreparationofrecombinantproteinDerp23anddevelopmentofitsspecificIgEbychemiluminescencemethod

ZHOUYing,WUMei鄄Li,ZHUHan鄄Ting,CUIYu鄄Bao郾DepartmentofPediatricsLaboratory,AffiliatedWuxiChildren忆sHospital,NanjingMedicalUniversity,Wuxi214023,China

specificIgEinsera郾Methods:cDNAcodingforDerp23wasamplifiedbyRT鄄PCRwithTotalRNAofdermatophagoidespteronyssinusinsertedintoplasmidstoconstructpET28a(+)鄄Derp23,transfectedintoE郾coliBL21cellsforexpressionwithinductionofrecombinantproteinwascoatedonchemiluminescentboardtodevelopchemiluminescencemethodfordetectionofspecificIgEagainst

[Abstract]摇Objective:TopreparerecombinantproteinDerp23allergenanddevelopachemiluminescencemethodtodetect

astemplateandprimersdesignedandsynthesizedaccordingtonucleotidesequencedepositedinGenBankNo郾EU414751郾cDNAwasIPTG郾RecombinantproteinwaspurifiedbyNickelaffinitychromatography,andidentifiedbySDS鄄PAGEandWesternblot郾ThisDerp23,whichwascomparedwithImmunoCAPmethodindetectionseraIgEfrompatientswithallergicrhinitisor/andasthma郾Results:BySDS鄄PAGEandWesternblotofpurifiedrecombinantprotein,asinglebandwasobserved郾Quantitativeanalysisshowed0郾5mlofpurfiedproteinatconcentrationof0郾25mg/mlandpurificationatmorethan95%郾Byusingachemiluminescencemethoddevelopedwiththisrecombinantprotein,positiveratewas郾8%forpatientswithallergicrhinitisor/andasthma郾AtthesamebetweenourchemiluminescencemethodandImmunoCAPmethod(字2=0郾237,P=0郾626)郾Conclusion:RecombinantproteinDerp23componentresolveddiagnosisofallergen郾

agnosis

time,specificIgEwas95郾92%byImmunoCAPmethod(goldstandard)郾TherewasnostatisticallydifferentinspecificIgEdetectionwasprepared,andchemiluminescencemethodwasdevelopedsuccessfullyfordetectionofit,whichprovideatechnologyplatformfor

[Keywords]摇Recombinantallergens;Chemiluminescenceimmunoassay;Dermatophagoidespteronyssinus;Componentresolveddi鄄

淤本文为无锡市卫计委重大课题(Z201701)。于无锡市人民医院检验科,无锡214023。盂通讯作者,E鄄mail:ybcui1975@hotmail郾com。

作者简介:周摇鹰,女,硕士,副研究员,主要从事尘螨与过敏性疾病方面的研究,E鄄mail:home0518@163郾com。

摇摇尘螨种类较多,其中有30余种与人类疾病密切相关,是过敏性哮喘、过敏性鼻炎和消化道过敏性疾病的重要危险因素[1]。尘螨及其过敏原通过氧化解作用引起胃肠道炎症[2]。我国呼吸道过敏性疾患者进行了调查,粉尘螨、屋尘螨和热带无爪螨皮肤挑刺试验阳性率分别为59%、57郾6%和40郾7%,说明此3种螨是我国过敏性疾病常见致敏螨种[3]。

引起过敏性疾病的抗原物质称为过敏原。世界

KitVer郾4郾0(CodeNo郾9762)购自TaKaRa公司;In鄄Fusion襆HDCloningKit(CodeNo郾6398)购自Clontech公司;HiTrapTALONcrude、5mlTALONSuperflow(CodeNo郾28鄄9537鄄66)购自美国GE公司;RNAeasyMiniKit(Qiagen74104)购自Qiagen公司;HRP鄄RabbitAnti鄄MouseIgG购自ZymedLaboratoriesR250染色液购自天根生化科技有限公司;BCIP/FF购自北京卓冠科技有限公司产品。

NBT购自Roche公司;亲和色谱填料镍琼脂糖凝胶1郾1郾3摇仪器摇Phadia过敏原检测仪(ImmunoCAP美国赛默飞;PCR仪(CatNo郾TP600)购自TaKaRaImageMaster襆VDS电泳成像装置购自Pharmacia1郾2摇方法

DNA测序仪购自PerkinElmer公司。

System,ThermofisherScienfific,Uppsala,Sweden)购自公司;Mupid电泳仪购自Advance鄄Bio公司;Biotech公司;ABIPRISMTM377XLDNASequencer1郾2郾1摇屋尘螨培养摇根据参考文献[5]培养屋尘25郾1益、相对湿度(75依5)%培养。

螨,培养基为酵母粉和鱼食按一定比例混合,置于(CA,USA);PVDF膜、Westernblot膜封闭液、CBB鄄

反应损伤肺细胞的蛋白质、脂质和DNA,通过酶水病研究联盟对17座城市6304例哮喘合并/或鼻炎

卫生组织/国际免疫联合会根据生物体产生的过敏原的发现顺序及氨基酸序列同源性予以命名,已公布屋尘螨过敏原23组分、粉尘螨过敏原32组分、热带无爪螨过敏原14组分。2013年,澳大利亚学者Weghofer等[4]报道从屋尘螨gt11cDNA表达文库中74%屋尘螨过敏患者血清结合,阳性率高于过敏原的屋尘螨过敏原主要组分。本研究制备屋尘螨重组蛋白Derp23,建立了化学发光法检测该组分与屋尘螨过敏性疾病患者血清IgE结合率,结果报告如下。

筛选出过敏原Derp23,其大肠杆菌表达产物可与主要组分Derp1和Derp2,因此被认为是新发现

1郾2郾2摇引物设计与合成摇依据GenBank公布的序列(No郾EU414751),去掉5忆端21个氨基酸的编码序列,设计并合成引物,F:5忆鄄AATGGGTCGCGGATC鄄CGCCAATGATAATGATGATGATCCTACC鄄3忆,R:5忆鄄T鄄GCTCGAGTGCGGCCGCTTAAGTGCATGTTTCTTCATC鄄TTCATTC鄄3忆,片段两侧添加BamH玉/Not玉酶切位点。1郾2郾3摇质粒pET28a(+)鄄Derp23构建摇用RNAiso

1摇材料与方法

1郾1摇材料

1郾1郾1摇血清摇采集南京医科大学附属无锡市人民医院检验科过敏原检测获得的屋尘螨过敏原阳性血清(MediwissAnalyticGmbH,德国),且乙肝表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎抗体(抗鄄HCV抗体)、人类免疫缺陷病毒1/2抗体(抗鄄HIV1/2抗体)和梅毒螺旋体抗体(抗鄄TP抗体)均为阴性。所有血清经确认屋尘螨过敏原特异性阳性,即特异性IgE>0郾35KU/L。阳性血清中,2例1级、11例2级、15例3级、7例4级、5例5级、9例6级,患者的临床诊断为过敏性鼻炎或/和过敏性哮喘。本研究经无锡市人民医院伦理委员会批准(伦理审查号:KYLLH2018034),因所用血清样本为临床检验剩余1郾1郾2摇试剂摇载体pET28a(+)和大肠埃希氏菌菌株E郾coliBL21(DE3)plysS为本实验保存。工具酶BamH玉和Not玉、DNAladder、E郾coliCompetentCellsJM109(CodeNo郾D9052)、RNAisoPlusKit(CodeNo郾9108Q)、PrimeScriptTM

No郾RR014A)、TksGflexDNAPolymeraseKit(Code

RT鄄PCR

Kit

(Code

样本,无需知情同意。

PlusKit提取屋尘螨TotalRNA,以TotalRNA为模板,使用PrimeScriptTMRT鄄PCRKit合成cDNA,以反转录的cDNA为模板,以INF1/INR1为引物进行使用MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitPCR扩增,取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,Ver郾4郾切胶回收目的扩增条带,使用In鄄Fusion襆HD行连接反应,反应产物热转化至E郾coliCompetent引物T7、T7terminator进行测序验证。

CloningKit将回收的目的基因与质粒pET28a(+)进CellsJM109中,挑选阳性菌落植菌,提取质粒,使用

1郾2郾4摇目的蛋白表达、纯化与鉴定摇取1滋l质粒pET28a(+)鄄Derp23转化至CompetentcellRosetta2(DE3)pLysS中,各取80滋l转化液分别涂布含于抗生素Kana(50滋g/ml)平板和LB抗生素Kana(50滋g/ml)+Cm(34滋g/ml)平板,37益培养过夜。以空质粒pET28a(+)为对照同步操作。挑取单菌落分别放置于2mlLB/Kana(50滋g/ml)和2mlLB/

No郾R060A)、MiniBESTAgaroseGelDNAExtraction

Kana(50滋g/ml)+Cm(34滋g/ml)培养基,37益培养过夜。行主培养诱导,在Glasstube中加入5mlLB/Kana(50滋g/ml)和5mlLB/Kana(50滋g/ml)+Cm(34滋g/ml)培养基,添加培养菌液100滋l。37益

2摇结果

2郾1摇屋尘螨过敏原Derp23重组蛋白制备结果摇以屋尘螨TotalRNA为模板,RT鄄PCR扩增Derp23的活性部位编码基因见图1,将构建的原核表达质粒pET28a(+)鄄Derp23转化至CompetentcellRosetta2(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,柱层析纯化,获得目的蛋白0郾5ml,浓度为0郾25mg/ml,纯度带结果见图2。

>95%,SDS鄄PAGE鉴定结果及Westernblot目的条

1mmolIPTG)进行诱导,37益培养4h。集菌前吸光度值为1郾80,集菌后,在菌体中加入320滋lPBS悬浊后进行超声波破碎,12000r/min离心5min。4伊SDSLoadingBuffer,95益加热10min,行SDS鄄PAGE电泳。电泳条件:25mA/枚、70min,12郾5%polyacrylamidegel,CBB鄄R250染色,脱色液脱色。转膜,将PVDF膜置于含1郾5%BSA的12mlBlockingBuffer中,4益平放过夜封闭。取稀释后的Penta鄄HisAntibody溶液9ml,加入一抗反应1h。TBST缓冲液(20ml)洗涤2次,TBS缓冲液冲洗3次。使用稀释后的HRP鄄RabbitAnti鄄MouseIgG抗体溶液9ml,加入二抗反应1h。TBST缓冲液(20ml)洗涤2次,TBS缓冲液冲洗3次。1mlTrueBluePeroxidaseSubstrate显色1min。

取全蛋白提取物、上清液、沉淀物各8滋l,加入2滋l

培养至OD600为0郾6,加入150mmolIPTG34滋l(final

2郾2摇化学发光检测方法的建立摇以国际通行的>

0郾35U/ml为阈值判定标准,49例患者中,有44例与重组蛋白Derp23反应,反应率为郾8%。以UniCAP方法同步检测呈过敏性疾病患者血清,47例呈阳性,阳性反应率为95郾92%。两种方法检测结果差异无统计学意义(字2=0郾237,P=0郾626)。

以UniCAP方法为状态变量,以本文所建化学发光法作

1郾2郾5摇化学发光检测方法的建立摇取重组蛋白,配制成5滋g/ml溶液。按照说明书操作:淤包被:采用4%BSA鄄PBS,37益封闭2h,置于37益干燥2h;于加样:取重组过敏原包被的化学发光板,50滋l/孔加入样品稀释液混匀。质控品孔中加入100滋lSS2(磷酸盐缓冲液,含3郾5U/ml人IgE、2%BSA和重组蛋白包被化学发光板,2~8益过夜,加150滋l

图1摇Derp23PCR产物电泳图和序列测定结果Fig.1摇

PCRamplificationofDerp23identifiedbyagaroseelectrophoresisandnucleotidesequen鄄cing

Note:A郾PCR

M1郾DL2000DNAMarker;1郾pET28a(+)鄄Derp23;2郾RT鄄PCRproductofDerp23郾

agarose

electrophoresis;B郾Nucleotide

sequencing.

0郾25%%Proclin鄄300)和SS4(磷酸盐缓冲液、含300);盂孵育:用封板膜封好包被板,37益孵育45min;榆洗板:每孔加入不少于350滋l稀释好的工作洗液,静置30min,拍干,共洗板5次;虞第2次加样:100滋l/孔加入酶结合物;愚孵育;舆洗板;余加发光底物液:每孔加入底物A液(柠檬酸鄄氢氧化钠缓冲液、Luminol)和B液(柠檬酸鄄乙酸钠缓冲液、过

17郾51U/ml人IgE、含2%BSA和0郾25Proclin鄄

氧化氢脲)各50滋l,振荡混匀,室温避光放置5min;俞化学发光免疫分析仪测量每孔RLU;逾结果计算:选用双对数拟合软件自动计算出待测样本结果。诊断结果为金标准,计算本文化学发光法检测的Der1郾3摇统计学处理摇采用SPSS18郾0软件进行数据分析。两组样本率比较采用字2检验,以曲线下面积(AUC)作为衡量依据,取Youden指数最大时作为最佳截断(Cut鄄off)值。以P<0郾05为差异有统计学意义。

p23特异性IgE阴性、阳性测定值,并进行字2检验。

1郾2郾6摇方法学比对摇以美国赛默飞Phadia过敏原

图2摇纯化后的重组蛋白鉴定

Fig.2摇Identificationofrecombinantproteinafterpurifi鄄

cation

Note:A郾SDS鄄PAGE;B郾Westernblot;M郾ProteinMWmarker(broad);

1郾2滋lofrecombinantprotein;2郾4滋lofrecombinantprotein;3郾200ngBSA;4郾500ngBSA;5郾1000ngBSA;6郾1500ng8郾1滋lrecombinantprotein;M2郾Perfectproteinmarker郾

BSA;7郾2000ngBSA郾B郾M1郾Precisionplusproteinstandards;

组分包被化学发光板建立了化学发光检测方法,检测了针对Derp23的特异性IgE。美国赛默飞已开发出Derp1、Derp2、Derp23的单组分检测试剂,但目前仅限于科学研究使用。比较本文建立的化学发光免疫分析法和Phadia过敏原Derp23检测结果,差异无统计学意义,说明本文成功建立了过敏原单组分化学发光免疫分析法。

图3摇尘螨过敏原Derp23特异性IgE化学发光法ROC

曲线

Fig.3摇ROCcurveforDerp23specificIgEdetected

bychemiluminescence

Phadia过敏原诊断系统采用粗提浸液为包被抗原,

参考文献:

[1]摇TulicMK,Vivinus鄄N佴botM,RekimaA,etal郾Presenceof

commensalhousedustmiteallergeninhumangastrointestinaltract:Apotentialcontributortointestinalbarrierdysfunction[J].Gut,2016,65(5):757鄄766郾297鄄299郾

为检验变量,绘制ROC曲线,AUC为0郾952。见图3。

[2]摇LusiC郾Miteallergens[J].ExpRevClinImmunol,2017,13(4):[3]摇LiJ,SunB,HuangY,etal.Amulticentrestudyassessingthe

prevalenceofsensitizationsinpatientswithasthmaand/orrhinitisinchina[J].Allergy,2009,(7):1083鄄1092郾

peritrophin鄄likeprotein,asanewmajorDermatophagoidespteronyssinusallergenassociatedwiththeperitrophicmatrixofmite[5]摇刘摇良,彭江龙,周摇鹰,等郾屋尘螨cDNA表达文库的构建及

初步鉴定[J].第四军医大学学报,2008,29(2):143鄄146郾LiuL,PengJL,ZhouY,etal.ConstructionandidentificationofacDNAlibraryforDermatophagoidespteronyssinus[J].JFourthMil[6]摇ChuaKY,StewartGA,ThomasWR,etal郾Sequenceanalysisof

cDNAcodingforamajorhousedustmiteallergen,Derp1175鄄182郾

homologywithcysteineprotease[J].JExpMed,1988,167:structuralanalysesofthemajormiteallergenDerp23[J].ClinExpAllergy,2016,46(2):365鄄376郾MedUniv,2008,29(2):143鄄146郾

fecalpellets[J].JImmunol,2013,190(7):3059鄄3067郾

3摇讨论

克隆和基因序列。目前,世界卫生组织/国际免疫联合会官网(www郾allergen郾org)已公布屋尘螨过敏原23组分,其中第1组分Derp1和第2组分Derp2与屋100%,被认为是主要组分。在粗提浸液质量标准化时,以第1、2组分浓度测定为依据。近年发现屋尘螨过敏原第23组分Derp23也是过敏原的主要组分,与Derp1、Derp2具有同等重要的临床价值,其血清IgE结合率高达46%~74%[7]。Derp23位于螨粪球几丁质膜,嗜碱性粒细胞脱颗粒试验显示其活性较高

[8]

Chua等

[6]

报道了屋尘螨过敏原第1组分cDNA

[4]摇WeghoferM,GroteM,ReschY,etal.IdentificationofDerp23,a

尘螨过敏性疾病患者血清IgE结合率为60%~

清,Derp23单组分反应率高达郾8%,表明该组分过敏原是我国过敏性疾病患者重要的致敏蛋白之一。

目前,临床检测过敏原主要采用尘螨粗提浸液制品为包被抗原,不同批次产品含有的过敏原单组分种类及含量不稳定,某种或某些组分的免疫原性偏低,含有非过敏原性物质,甚至有毒物质,所以很难实现质量标准化,从而影响检测结果

[9,10]

。本研究检测49例屋尘螨过敏性疾病患者血

[7]摇MuellerGA,RandallTA,GlesnerJ,etal郾Serological,genomicand[8]摇WeghoferM,GroteM,ReschY,etal郾IdentificationofDerp23,a

pteronyssinusallergenassociatedwiththeperitrophicmatrixofmitefecalpellets[J].JImmunol,2013,190:3059鄄3067郾Pharmacol,2018,32:1鄄8郾(3):249鄄256郾

peritrophin鄄likeprotein,asanewmajordermatophagoides

[9]摇LiL,QianJ,ZhouY,etal郾Domesticmite鄄inducedallergy:Causes,

diagnosis,andfutureprospects[J].IntJImmunopatholclinicalpractice[J].AnnAllergyAsthmaImmunol,2017,118

[10]摇Carn佴sJ,IraolaV,ChoSH,etal郾Miteallergenextractsand[11]摇AseroR郾Lookingforsensitizationprofilesindifferentpopulations[12]摇CanonicaGW,AnsoteguiIJ,PawankarR,etal郾AWAO鄄ARIA鄄

GA2LENconsensusdocumentonmoleulcar鄄basedallergydiagnostic[J].WorldAllergyOrganJ,2013,6(1):17郾1:106鄄108郾

byrecombinantallergens[J].IntArchAllergyImmunol,2014,

DNA技术为过敏原制备提供了新的手段,重组过敏原单组分的优点是物理、化学、免疫学特征明确。用纯化或重组的过敏原单组分进行组分分辨诊断能够从分子水平检测患者过敏谱,提高诊断精准性,从交叉反应中鉴别出致敏原单组分,评估过敏反应类型,帮助临床选择合适的过敏原单组分进行脱敏治疗

[11,12]

。重组

疫分析法检测试剂盒检测过敏原特异性IgE采用的22种。本文参考该试剂盒说明书,以重组过敏原单是粗提过敏原浸液,包括蒿属花粉、屋尘螨、花生等

。北京协和新华联公司销售的化学发光免

[收稿2019鄄07鄄11摇修回2019鄄11鄄05]

(编辑摇周文瑜)

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