6-甲基-2-(α-羟甲基)-1H-苯并咪唑荧光分子探针法测定蛋白质
在生物体中，蛋白质是必不可少的生命物质。有关蛋白质的各类研究，是目前生命科学、化学和临床医学研究同感兴趣的课题。目前，蛋白质含量的测定方法很多，主要有荧光分析法、分光光度法、共振光散射法和毛细管电泳法等。荧光法由于具有多种测定参数、选择性好、灵敏度高而倍受广大分析工作者的关注。但是，由于蛋白质本身的内源荧光很弱，用上述方法测定势必受到诸多。
6-甲基-2-(α-羟甲基)-1H-苯并咪唑是一种强荧光试剂(MHMBM)，在一定的实验条件下， MHMBM于301 nm处有一强荧光发射现象，而蛋白质(BSA)的存在，可使MHMBM的荧光得到显著增强。基于这样的原理，利用BSA对MHMBM的荧光增敏作用，可实现蛋白质含量的测定。
1 主要仪器与试剂
VARIAN Cary 荧光分光光度计(美国瓦里安公司)；低温恒温槽(宁波江南仪器厂)；Elix5+ Milli-QG超纯水系统 (美国Millipore公司)。
MHMBM溶液：准确称取MHMBM 0.1000 g，用1000 mL容量瓶定容，此溶液浓度为100 μg/mL，使用时稀释至10 μg/mL。
牛血清蛋白(BSA，上海源聚生物科技有限公司，纯度>98%，分子量68000)溶液：准确称取0.2500 g BSA，溶解后，转入250 mL容量瓶定容，此溶液的浓度为1.0 mg/mL(于1-4℃冰箱中保存)。
其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。
2 实验方法
移取0.1 mL MHMBM溶液于10 mL比色管中，准确移取3.0 mL于比色皿中，在278 nm光激发下，测定其荧光发射强度(F0)，按照光度滴定方法，先后加入6.0、9.0、15.0、15.0、15.0 μL BSA溶液(3.0 mL MHMBM溶液中，所对应的BSA浓度依次为2.0、5.0、10.0、15.0及20.0 μg/mL)，并在每次加入BSA静置5 min后进行荧光强度的测定(Fi)，以MHMBM空白溶液的荧光强度(F0)作参照，计算体系的ΔF，以ΔF对c(BSA)做回归分析。
同样条件下，用同样的方法测定试液的荧光强度，根据线性方程计算样品溶液中的蛋白质含量。
3 MHMBM的激发与发射光谱
取0.1 mL MHMBM于10 mL比色管中，用超纯水稀释至刻度，移取适量溶液于比色皿中，在
278 nm光激发下，测定MHMBM的发射光谱，实验结果如图1所示。由图可得，MHMBM的最大发射光波长为301 nm。
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图1 MHMBM荧光发射光谱(a)和蛋白质加入后的增敏效果(b)
4 标准曲线与检出限
按实验方法配制溶液并测定MHMBM的荧光强度，结果如表1所示，根据数据绘制标准曲线。回归后的线性方程为：ΔF= ，相关系数(r)为 。
表1 标准曲线数据表
MHMBM (mL) BSA(μg/mL) F ΔF 0.0 2.0 5.0 0.1 10.0 15.0 20.0
移取0.1 mL MHMBM于10 mL比色管中，用超纯水定容后配制成空白溶液，测定该溶液的荧光强度(11次)，测定结果的标准偏差σn-1= ，按3σ/S计算，方法的检出限为 μg/mL，线性范围为： μg/mL。
5 试液中蛋白质含量测定
按照实验方法配制MHMBM溶液，准确移取3.0 mL于比色皿中，加入30.0 μL蛋白质样品溶液，在278 nm光激发下，分别测定加入BSA前后MHMBM的荧光强度，并计算其增敏值(ΔF)，根据线性方程计算试液中蛋白质含量。结果列入表2。
表2 样品溶液中蛋白质的测定结果 (n = 6)
样 品 测定值 (μg/mL) RSD (%) 平均值 (μg/mL) 置信区间 (P0.95)
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