生物信息学分析 (作业模板)

乳腺癌转移抑制基因BRMS1在果蝇中同源基因

CG4400的生物信息学分析

（XX学院xx专业

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摘要：乳腺癌是西方国家妇女中发病率和致死率最高的癌症之一，而癌转移是导致癌症死亡率高的最主要原因，因此研究与癌症转移相关的基因具有十分重要的意义。与癌转移相关的基因分为癌转移促进基因和癌转移抑制基因。BRMS1是新发现的一个乳腺癌抑制基因，由于在人和小鼠对于其分子作用机制研究的困难，所以用果蝇作为模式动物来进行研究。本文对果蝇中BRMS1基因的同源基因CG4400的蛋白质序列进行生物信息学分析，得到一些关于蛋白质结构的预测信息，以指导今后的工作。

关键词：乳腺癌转移抑制基因 BRMS1 CG4400 生物信息学分析

背景介绍

在西方国家中，乳腺癌是妇女中发病率和致死率最高的癌症之一[1]。在美国，从1970年至今，人群中乳腺癌的致死率几乎没有变化[2]。当肿瘤只局限在乳腺中时，乳腺癌的治愈率超过90%。而当癌细胞发生转移时，长期的存活率就取决于癌细胞扩散的程度和位置。转移至内脏器官和脑部最为危险，五年的存活率降低至不到20%[3]。癌转移是一个多步的过程，转移过程中癌细胞从原发肿瘤的位置扩散，并在另一个器官中形成二级肿瘤[4]。癌转移是癌症患者死亡的最主要原因。而肿瘤的发生和转移归因于细胞的遗传学改变的积累，这一观点已被人们广泛接受。因此，找到与肿瘤发生和转移相关的基因，理解其分子机制就非常必要了，这也成为当今生物学家研究的一个热点。

与乳腺癌转移相关的基因分为两类，一类为转移促进基因，其定义类似于原癌基因,促进非转移细胞发生转移，包括ras, MEK1, mta1, proteinases, adhesion molecules, chemoattractants/receptors, autotaxin, PKC,S100A4,

RhoC, osteopontin等，其中一些基因还有原癌基因的功能，例如ras和MEK1。还

有一类为转移抑制基因，它们不影响原发肿瘤的生长而只抑制其转移，包括Nm23, E-cadherin, TIMPs, KiSS1,Kai1, Maspin, MKK4, BRMS1等。这里需注意的一点是转移抑制基因与肿瘤抑制基因的区别，肿瘤抑制基因不仅减缓原发肿瘤的生长，还抑制肿瘤转移[5]。至今对于癌转移抑制基因作用的分子机制了解还很少，只有Nm23基因的研究较为清楚。研究结果表明NM23与Ras相关蛋白GTPase Rad相互作用[6]， NM23家族的成员NM23H1还Rho家族的GTPase[7]。

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本文主要讨论的是乳腺癌转移抑制基因BRMS1（Breast metastasis suppressor 1）。这个基因最早是用差异显示（differential display）的方法，通过比较转入具有抑制癌转移功能的人类11号染色体的MDA-MB-435细胞和其亲代具有转移能力的细胞得到的，这个基因定位于人类染色体的11q13.1-q13.2区域，该区域在晚期的乳腺癌细胞中经常发生改变。稳定转染BRMS1能显著降低 MDA-MB-435 和 MDA-MB-231乳腺癌细胞的转移能力而不影响其肿瘤的发生[8]。在鼠的乳腺细胞系和人的黑素瘤细胞系中这个基因也同样表现出抑制转移的活性[5]。迄今的研究结果表明，BRMS1在MDA-MB-435细胞中的表达可以改变细胞间的间隙连接(gapjunction),使其类似于正常的乳腺细胞[9]。BRMS1会与PBP1（Retinoblastoma- binding Protein 1）以及mSin3·HDAC（Histone Deacetylase Complex）形成复合物来抑制某些基因的转录，转录可能是BRMS1抑制癌细胞转移的机制[10]。但是对于BRMS1抑制癌转移的作用机制仍不清楚。BRMS1基因高度保守，在氨基酸水平上鼠的BRMS1基因与人的同源性高达95%[5]，由此给我们一个启示，即用经典的较低等的模式动物，如果蝇来进行BRMS1作用的分子机制的研究。以往所得到的研究结果都是在人类乳腺癌细胞系或小鼠中研究得到的，由于伦理道德等的原因，我们不可能用人进行活体试验，这样就并非真正意义上的体内试验，所得到的结果与实际情况会有一定的偏差；而小鼠的遗传背景较为复杂，试验的成本也较高，因此用果蝇来研究高度保守的基因的作用机制有很多优势，比如遗传工具繁多，遗传背景清楚，生活周期短，成本低等。对人类乳腺癌转移的研究可以借鉴果蝇中的研究成果。之前也曾有用果蝇来进行肿瘤抑制基因研究和癌转移抑制基因筛选的报道[11,12,13]。本文的目的就是对果蝇中的BRMS1基因的同源基因进行一些生物信息学分析，以期能够指导将来的研究工作。

方法与结果

首先，根据最先发现人类BRMS1基因的文章所提供的提交在NCBI上的该基因cDNA的序列号AF159141从NCBI上调出该cDNA序列，如下：

>gi|9828166|gb|AF159141.1|AF159141 Homo sapiens breast cancer metastasis-suppressor 1 (BRMS1) mRNA, complete cds

AGAAAAGGGAGCCGCGCAGCGCCTACGGGAGTCCGGCGGCAGCAGCCGGTACCGGCAACCACGGGCAGCTCTCAGGGAATCTCCGTCGTGAGGCCAGAGGCTCCAGTCCCCGCGAGTCCAGATGCCTGTCCAGCCTCCAAGCAAAGACACAGAAGAGATGGAAGCAGAGGGTGATTCTGCTGCTGAGATGAATGGGGAGGAGGAAGAGAGTGAGGAGGAGCGGAGCGGCAGCCAGACAGAGTCAGAAGAGGAGAGCTCCGAGATGGATGATGAGGACTATGAGCGACGCCGCAGCGAGTGTGTCAGTGAGATGCTGGACCTAGAGAAGCAGTTCTCGGAGCTAAAGGAGAAGTTGTTCAGGGAACGACTGAGTCAGCTGCGGTTGCGGCTGGAGGAAGTGGGGGCTGAGAGAGCCCCTGAATACACGGAGCCCCTTGGGGGGCTGCAGCGG

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AGCCTCAAGATTCGCATTCAGGTGGCAGGGATCTACAAGGGCTTCTGTCTGGATGTGATCAGGAATAAGTACGAATGTGAGCTGCAGGGAGCCAAACAGCACCTGGAGAGTGAGAAGCTGCTGCTCTATGACACGCTGCAGGGGGAGCTGCAGGAGCGGATCCAGAGGCTGGAGGAGGACCGCCAGAGCCTGGACCTCAGCTCTGAATGGTGGGACGACAAACTGCACGCCAGAGGCAGCTCCAGGTCTTGGGACTCCCTGCCGCCCAGCAAGAGGAAGAAGGCACCTCTGGTTTCTGGCCCATACATCGTGTACATGCTTCAAGAGATCGACATCCTGGAGGACTGGACAGCCATCAAAAAGGCTAGGGCAGCTGTGTCCCCTCAGAAGAGAAAATCGGATGGACCTTGACCCTGCTGTTCACAGCCAGGGGGACCCTCAGAGCAGCTGGCACTGCACCCAGGATTCTCGTCTTCCTCCTGCAGACAGGCGGACCCACAGGCCCCTCAGGGTCTGCCCAGCCAGGCTCCTGTGGTGCTGCTGGGCCCTCCCACTCCATCTGGCACTGGCCTGGACTCCTCCTCTGCCCTCCTCGAGGCCTGCACAGCTGTGGCCGTGGAGCTGACCTGACCAGGCAAGGCTGCTGTCTCCATCCCTGAGCCGCCTGCCACCTCCCACTCCTGAAGATCCATCTCTTGGGGCTCCCCTGACAGAGAAGACAGCCGAAGTCAAAGCCACATCCTCTTGCTGATGTTGGATGCAGGCTGTCCAGCCTCAGGGCCAGGGAGCCAAGTTTCCACTGTGCGGGAACTCTGAGTCAGAACGTTGATTATCTGGGGGTCTTGTCCACCCTGGCTGGATCTGGAGGCAAGATGCCAGGCCCCCCAAGGTGTTCTCAGGGCAAGTTCTTGGTGTCTGCTTTCTCAGATTCCAAGGACTGGAATTAAAACCTTTCCTGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

其翻译所得的蛋白质序列（NCBI序列号AAG00075）为：

>gi|9828167|gb|AAG00075.1|AF159141_1 breast cancer metastasis- suppressor 1 [Homo sapiens]

MPVQPPSKDTEEMEAEGDSAAEMNGEEEESEEERSGSQTESEEESSEMDDEDYERRRSECVSEMLDLEKQFSELKEKLFRERLSQLRLRLEEVGAERAPEYTEPLGGLQRSLKIRIQVAGIYKGFCLDVIRNKYECELQGAKQHLESEKLLLYDTLQGELQERIQRLEEDRQSLDLSSEWWDDKLHARGSSRSWDSLPPSKRKKAPLVSGPYIVYMLQEIDILEDWTAIKKARAAVSPQKRKSDGP

然后所得到的蛋白质在Flybase果蝇基因组数据库用Blastp命令、选择 Swissprot and TREMBL proteins(AA)数据库进行蛋白质序列比对，其结果如下：

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Score E

Sequences producing significant alignments: (bits) Value Q9VYI2 CG4400 protein (LD145p). 127 5e-30 Q8MS11 RE74901p. 62 5e-10 Q9VWG2 CG14220 protein. 62 5e-10 Q9VHG1 CG8454 protein (RE66051p). 35 0.060 Q9V385 PNUT protein (LD37170P). 32 0.39 PNUT_DROME Peanut protein. 32 0.39 Q9V951 CG9945 protein (AT18160p). 28 4.3 Q9VTS7 CG6793 protein. 28 4.3 KL61_DROME Bipolar kinesin KRP-130 (Kinesin-like protein Klp61F). 28 4.3 AAF47436 CG18214-PA (CG18214-PC). 28 5.6 Q9W0L0 RHO family guanine nucleotide exchange factor TRIO (Guanine- 28 5.6 Q8IGY6 RE05346p (Fragment). 28 7.3 Q9VUA3 CG32137 protein. 28 7.3 Q8SWR2 RE18568p (CG32137 protein). 28 7.3 Q8IMX3 CG6129-PC. 27 9.5 Q9VCD1 CG6129-PB. 27 9.5 Q8IQ08 CG2808-PA. 27 9.5 Q8MSN3 AT16851p. 27 9.5 Q9VEF5 CG7379 protein (GH01429p). 27 9.5

由此结果可知，黑腹果蝇中CG4400基因为人BRMS1基因的同源基因。在Flybase中查找CG4400基因的信息，得知CG4400定位于果蝇的X染色体的11D1区域，其蛋白质序列为：

>CG4400-PA type=protein; loc=X:complement(12639007..12639348,12639596.. 12639840,12639908..120097); ID=CG4400-PA; name=CG4400-PA; db_xref= FlyBase:FBpp0073526,GB_protein:AAF48213.2,FlyBase:FBgn0030434,FlyBase:CG4400-PA; len=259

MPVKNGESDGEGDVSGGESEHSNSSQPHDTSDEEEANECDSDDSSELDASEIDRRRAEHIEDLLSLERQFNELREQYYVERINLIERQLAEVRSGRSEEFVQPQKELDKKYRTRIEVADVLRKYRLQNIEHKYQSEEQAAVQHFESEKHMALDNLREEFMERIRRLEEDRHNVDISWADWGTDKRQSKVRGPGRKKAVTVTGPYVVYMLREEDIMEDWTIIRKALKRSSSSATAAGTVTPTSGVSVSLSGLPAMAGASG

接着对于CG4400的蛋白质序列用Unix进行基本的蛋白质信息分析：

首先，用pepstats分析氨基酸组成，其结果如下：

Molecular weight = 29560.36 Residues = 259 Average Residue Weight = 114.133 Charge = -13.5 Isoelectric Point = 4.6782

A280 Molar Extinction Coefficient = 26030

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A280 Extinction Coefficient 1mg/ml = 0.88

Probability of expression in inclusion bodies = 0.757

Residue Number Mole% DayhoffStat A = Ala 17 6.5 0.763 B = Asx 0 0.000 0.000 C = Cys 1 0.386 0.133 D = Asp 19 7.336 1.334 E = Glu 35 13.514 2.252 F = Phe 4 1.544 0.429 G = Gly 15 5.792 0.6 H = His 7 2.703 1.351 I = Ile 11 4.247 0.944 K = Lys 13 5.019 0.761 L = Leu 17 6.5 0.887 M = Met 6 2.317 1.363 N = Asn 8 3.0 0.718 P = Pro 7 2.703 0.520 Q = Gln 11 4.247 1.0 R = Arg 24 9.266 1.1 S = Ser 27 10.425 1.4 T = Thr 10 3.861 0.633 V = Val 17 6.5 0.995 W = Trp 3 1.158 0.1 X = Xaa 0 0.000 0.000 Y = Tyr 7 2.703 0.795 Z = Glx 0 0.000 0.000

Property Residues Number Mole% Tiny (A+C+G+S+T) 70 27.027 Small (A+B+C+D+G+N+P+S+T+V) 121 46.718 Aliphatic (I+L+V) 45 17.375 Aromatic (F+H+W+Y) 21 8.108 Non-polar (A+C+F+G+I+L+M+P+V+W+Y) 105 40.541 Polar (D+E+H+K+N+Q+R+S+T+Z) 154 59.459 Charged (B+D+E+H+K+R+Z) 98 37.838 Basic (H+K+R) 44 16.988 Acidic (B+D+E+Z) 54 20.849

然后用pepinfo命令分析氨基酸残基的信息，结果如下： 5

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接着用tmap命名查看该蛋白是否有跨膜区（结果如下图所示），可见该蛋白没有明显的跨膜区域。

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生物信息学课程作业 最后再用garnier命令显示蛋白质二级结构，其结果如下： . 10 . 20 . 30 . 40 . 50 MPVKNGESDGEGDVSGGESEHSNSSQPHDTSDEEEANECDSDDSSELDAS helix HHHHHHHHHH HHHHHHH sheet EE turns TT TTTT TT coil CCCCCCC CCCCCCCCC CCCCCCC . 60 . 70 . 80 . 90 . 100 EIDRRRAEHIEDLLSLERQFNELREQYYVERINLIERQLAEVRSGRSEEF helix HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HH HHHHHHHHHHHHHHHHHH HH sheet turns T T coil C CCCCC . 110 . 120 . 130 . 140 . 150 VQPQKELDKKYRTRIEVADVLRKYRLQNIEHKYQSEEQAAVQHFESEKHM helix HHHHHHHH HHH HHHHHHHHHHHH H HHHHHHHHHHHHHHHH sheet EEE turns T coil C CCCCC . 160 . 170 . 180 . 190 . 200 ALDNLREEFMERIRRLEEDRHNVDISWADWGTDKRQSKVRGPGRKKAVTV helix HHHHHHHHHHHHHHHHHH sheet E E EEEEE turns TTTT T T TT TTTTTT T TT T coil C C C C CC C . 210 . 220 . 230 . 240 . 250 TGPYVVYMLREEDIMEDWTIIRKALKRSSSSATAAGTVTPTSGVSVSLSG helix HHHHHHHHHHHHHHHH sheet EEEEEEEE EEEEEE EEEEEE turns TT T coil C CCCCCCC C CC 0

LPAMAGASG helix HHHH sheet EE turns coil C CC

Residue totals: H:137 E: 34 T: 32 C: 56 percent: H: 56.4 E: 14.0 T: 13.2 C: 23.0

通过以上分析，得到了关于该蛋白的一些基本的信息。

接下来在Prosite数据库中用ScanProsite程序（参数选项均为默认值）预测该蛋白中有哪些特征序列，结果预测出有8个酪蛋白激酶II(CKII)磷酸化位点，1个天冬酰胺N末端糖基化位点，3个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、1个双向核定位序列、2个cAMP和cGMP依赖性的蛋白激酶磷酸化位点、1个Amidation位点、1个N末端十四烷基化位点。具体结果如下：

PS00006 CK2_PHOSPHO_SITE Casein kinase II phosphorylation site :

SdgE 8 - 11:

15 - 18: SggE 30 - 33: TsdE 31 - 34: SdeE 45 - 48: SelD 50 - 53: SeiD

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113 - 116: TriE 176 - 179: SwaD

PS00001 ASN_GLYCOSYLATION N-glycosylation site : 23 - 26: NSSQ

PS00005 PKC_PHOSPHO_SITE Protein kinase C phosphorylation site : 94 - 96: SgR 146 - 148: SeK 182 - 184: TdK

PS00007 TYR_PHOSPHO_SITE Tyrosine kinase phosphorylation site : 105 - 111: Kel.Dkk.Y

PS00015 NUCLEAR Bipartite nuclear targeting sequence : 109 - 125: KKyrtrievadvlrkyr

PS00004 CAMP_PHOSPHO_SITE cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site : 184 - 187: KRqS 226 - 229: KRsS

PS00009 AMIDATION Amidation site : 192 - 195: pGRK

PS00008 MYRISTYL N-myristoylation site : 243 - 248: GVsvSL

再用Unix软件的water命令，比对人类BRMS1和果蝇CG4400序列，以找到保守区域，参数的设置为Matrix: EBLOSUM62，Gap_penalty: 10.0，Extend_penalty: 0.5。结果如下：

Length: 235 Identity: 92/235 (39.1%) Similarity: 147/235 (62.6%) Gaps: 14/235 ( 6.0%) Score: 434.0

CG4400-PA 1 MPVKNGESDGEGDVSGGESEHSNSSQPHDTSDEEEANECDS-DDSSELDA 49 |||:....|.|...:.|:|....:.:..::.:|...::.:| ::|||:|. 1 MPVQPPSKDTEEMEAEGDSAAEMNGEEEESEEERSGSQTESEEESSEMDD 50

CG4400-PA 50 SEIDRRRAEHIEDLLSLERQFNELREQYYVERINLIERQLAEVRSGRSEE 99 .:.:|||:|.:.::|.||:||:||:|:.:.||::.:..:|.||.:.|:.| 51 EDYERRRSECVSEMLDLEKQFSELKEKLFRERLSQLRLRLEEVGAERAPE 100

CG4400-PA 100 FVQPQKELDKKYRTRIEVADVLRKYRLQNIEHKYQSEEQAAVQHFESEKH 149 :.:|...|.:..:.||:||.:.:.:.|..|.:||:.|.|.|.||.||||. 101 YTEPLGGLQRSLKIRIQVAGIYKGFCLDVIRNKYECELQGAKQHLESEKL 150

CG4400-PA 150 MALDNLREEFMERIRRLEEDRHNVDISWADWGTDKRQSKVRGPG------ 193 :..|.|:.|..|||:||||||.::|:| ::|..||..: ||.. 151 LLYDTLQGELQERIQRLEEDRQSLDLS-SEWWDDKLHA--RGSSRSWDSL 197

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CG4400-PA 194 ----RKKAVTVTGPYVVYMLREEDIMEDWTIIRKA 224 ||||..|:|||:||||:|.||:||||.|:|| 198 PPSKRKKAPLVSGPYIVYMLQEIDILEDWTAIKKA 232

最后利用Swiss-Model数据库预测该蛋白的三维结构，设Lower BLAST limit=0.00001。结果没有找到与已知三维结构的蛋白一致性高于25%的蛋白，故无法预测其结构。又用3D-pssm和PredictProtein预测该蛋白三维结构，找到的与已知三维结构的蛋白质最高的一致性为21%，故无法较为准确地预测该蛋白三维结构。 讨论

该蛋白基本信息的分析，对于今后工作中该蛋白的分离纯化提供了非常有用的信息。由跨膜区分析和特征序列的分析结果可知，该蛋白中没有明显的跨膜区，而且有双向核定位序列，这点与人类BRMS1蛋白可能定位在核内并转录这点相一致。对人类BRMS1蛋白进行同样的特征序列分析，发现也有酪蛋白激酶II磷酸化位点、cAMP和cGMP依赖性的蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点以及十四烷基化位点。这暗示着果蝇CG4400蛋白与人类BRMS1蛋白可能有相似的分子作用和机制，而且经序列比对，果蝇CG4400基因与人类BRMS1基因蛋白序列有39.1%的一致性，62.6%的相似性，可见该序列高度保守。这样利用果蝇的遗传学研究优势，在果蝇中研究所得的结果将会指导人类乳腺癌转移的研究，所以我们的工作非常有意义。但是通过进行人类BRMS1蛋白和果蝇CG4400蛋白的序列比对分析，发现序列各区域保守性的高低似乎与这些特征序列没有明显的联系，根据我们现在普遍接受的观点，即认为保守性越高的区域功能越保守，可知也许是由于信息不足，所以分析出的结果不是很准确所致，但具有一定的指导意义。另外从各种蛋白质高级结构的分析结果来看，现在对于这种蛋白还所知甚少，只有通过各种试验证据和信息的积累，人们才能逐渐了解这个现在还很陌生的基因。而生物信息学分析将会和试验相辅相成，大大加快该基因的研究脚步。

致谢

感谢罗静初老师和陈新老师教给我生物信息学分析方法，给我的工作带来了很大的帮助。感谢杨勇飞同学对于本文的中肯建议。

参考文献

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13.Elisa C. Woodhouse, Amy Fisher, Russell W. Bandle, Bianca Bryant-Greenwood, Lula Charboneau,Emanuel F. Petricoin, and Lance A. Liotta，Drosophila screening model for metastasis:Semaphorin 5c is required for l(2)gl cancer phenotype,PNAS,2003, vol.100 no.20:11463–11468

本文中分析用到的站点：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://flybase.bio.indiana.edu/ http://cn.expasy.org/prosite/ http://swissmodel.expasy.org/

http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~3dpssm/

http://www.cbi.pku.edu.cn/predictprotein/ 部分分析工作在SSH Secure Shell Client软件中完成

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