金银花有效成分提取工艺的优化研究
陆凤琪，杨硕，胡勃，陈文成， 陆泉，储明明，王延明 指导老师：时维静教授
摘要：目的 研究金银花抑菌成分的最佳提取工艺。方法 以绿原酸为检测指标，研究了不同的提取方法对绿原酸含量的影响。并结合抑菌试验来综合考虑金银花抗菌成分的最佳提取工艺。结果 最佳提取工艺为乙醇回流提取法 关键词：金银花 绿原酸 提取工艺 抑菌活性
Extraction process of Antimicrobial Constituents From Flos
Lonicerae
Abstract：Objective：To study the optimum extracting condition of antimicrobial constituents from flos lonicerae. Methods: To determine the chlorogenic acid, the content of Chlorogenic acid was studied the effect of different extracting condition and the antimicrobial abilities by extract. Results: The optimum extracting condition was reflux extraction with alcohol Key words: flos lonicerae; chlorogenic acid; extraction process; antimicrobial abilities
金银花为忍科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、或毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或带初开的花。其中绿原酸为金银花的主要抑菌活性成分，具有清热解毒、抗菌消炎和抗衰老的作用，现代药理研究表明，其还具有保肝利胆、调节免疫、升高白细胞、降血压、降血脂、清除自由基，并对消化道的癌症有明显的抑制作用。
绿原酸类化合物是含有羧基和邻二酚羟基的有机酸，易溶于水，乙醇等溶剂。从金银花中提取绿原酸多采用煎煮法、浸渍法、回流法等，目前在分离绿原酸的方法常采用改良石硫法、水提醇沉法、乙醇热回流法、水提正丁醇萃取法等，但是在那种提纯方法最好，目前国内学者还没有确定的结论，有的人认为乙醇热回流法最好[1]，并且有人就乙醇热回流提取法进行了深入的研究[2] 。为了进一步了解那种提取方法对金银花中抑菌成分的提取效果最好，我们分别做了改良石硫法、水提醇沉法、乙醇热回流法、水提正丁醇萃取法，并用不同的提取物来做抑菌试验，结合了提取物中绿原酸的含量来确定金银花抑菌成分的最佳提取工艺。并且就乙醇热回流法做了正交试验，来寻找影响金银花中抑菌成分的提取的因素，为进一步优化金银花乙醇提取工艺提供参考。
1 材料和仪器
金银花购自安徽亳州药材市场，经安徽科技学院生命科学学院刘汗珍副教授鉴别本品为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的花蕾。绿原酸对照品购自（中国药品
生物制品鉴定所），其余试剂均为分析纯。
供试菌种：枯草芽孢杆菌；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；绿脓杆菌。（由安徽科技学院微生物实验室提供）
培养基：细菌用营养琼脂。蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15g葡萄糖5g水1000ml，PH值7.2。在121.3℃灭菌20min。
TU—1810 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；DHG—781 电热恒温培养箱（湖北省黄石市医疗器械厂）；RE 52—98 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ZDX—35 手提式压力蒸汽灭菌器。
2 方法与结果
2. 1 绿原酸提取方法的比较
常用的中药溶剂提取法有:浸渍法,渗漉法,煎煮法,回流提取法和循环提取法.目前金银花的提取方法主要有水提法,石硫法,水提醇沉法,乙醇回流法等。对各种提取纯化工艺进行比较评价的指标主要有:绿原酸得率,绿原酸提取率和绿原酸含量 2.1.1 改良石硫法
取金银花50克，加15倍量的水，浸提（温度不超过80度为好，避免破坏绿原酸的成分）。提取时间为2小时，再加水10倍量煎煮一个半小时，合并提取液静止12小时以后，浓缩至1：2.5（w/v），缓缓加入20%的石灰乳调PH值至10左右，离心，沉淀物，加入2倍量95%乙醇研磨成浆，搅拌下滴加50%硫酸调PH至3左右，充分搅拌，离心，酸水液用40%NaOH调PH为6左右，回收乙醇，减压烘干，得粗提取物。 粗提取物溶于2～3倍量水中，HCL调PH为2，以乙酸乙酯萃取数次，乙酸乙酯液用活性碳脱色，过滤，滤液浓缩后，分次加入适量的氯仿，滤取固体物，常压干燥，得淡黄色绿原酸固体。 2.1.2 水提正丁醇萃取法
取金银花50克，加10倍量的水，80度浸提2次，每次2小时，过滤并合并浸液，静止12小时，浓缩至比重1.15~1.20，浓缩液用50%硫酸调PH值3以下，以正丁醇萃取3次，合并萃取液，PH值调为6~7，减压回收溶剂，浓缩干燥。称取固体重量。 2. 1. 3 乙醇回流乙酸乙酯提取法
取20克金银花,加10倍量的50%乙醇, 80度浸提2次，每次1h，合并滤液，减压浓缩，回收乙醇，将浓缩液的PH值调至2左右，以4倍量的乙酸乙酯分4次萃取，合并萃取液，用适量水洗涤2次，以40%NaOH将PH值调为6~7，分取水层减压浓缩至稠膏，再干燥。 2.1.4 水提醇沉法
取20克金银花,加10倍量的水,80度浸提3次 ,每次1.5小时，然后将提取液过滤，滤液减压浓缩至相对密度为1.12～1.14（50度）的浓缩液；加入乙醇，使醇沉浓度达60%，冷藏24h，滤过，滤液回收乙醇至尽，减压真空干燥。
2.2 绿原酸的定性检验
2.2.1：取提取物10毫克，溶解在甲醇溶液中，然后吸取甲醇混匀液在硅胶H-CMC板上点样，以乙酸乙酯:甲醇:水（7:2.5:2.5）展开，待板干后，在紫外灯下，以365nm照射，则绿原酸显示蓝色荧光斑点。
2. 2. 2: 取提取物10毫克，溶解在蒸馏水中。然后取一支试管中加入醋酸和亚钠溶液，将提取物溶液取1毫升加入试管中，绿原酸在醋酸中与亚钠反应呈亮黄色，再加过量的NaOH，则颜色转为鲜红色。 2.3 绿原酸含量的测定
2.3.1 金银花中绿原酸含量的测定
供试品溶液制备：精密称取金银花干燥碎品(50℃干燥30 min)1g,置索氏提取器中,用60ml甲醇提取10小时.金银花提取液浓缩,定容50ml.精密吸取金银花甲醇溶液100μl于层析滤纸上点成条形,以正丁醇-醋酸-水(4:1:2)为展开剂展开14cm,取出晾干后,在紫外光灯下检视,层析结果.剪下绿原酸斑点,置带塞锥形瓶中,精密加入0.2mol·L-1盐酸溶液10ml,在超声波震荡器中放置12小时后,将溶液倒入10ml的容量瓶中，加0.2mol·L-1盐酸溶液置刻度，即得供试品溶液[3]。 2.3.2 提取物中绿原酸含量的测定
供试品溶液制备：精密称取4组提取物粉末2.0mg，在小烧杯中加蒸馏水溶解，然后移液至50ml的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，即得供试品溶液。
2.4 对照品溶液的制备：精密称取绿原酸标准品1.88mg，加蒸馏水溶解并定容至50ml容量瓶中，即得0.0376mg·ml-1的对照品溶液。
2.4.1 标准曲线的制备：分别取对照品溶液0.0、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0ml于10ml容量瓶中，摇匀，静置15min，进行全波长扫描，在325nm处均有最大吸收。以该波长处吸光值为纵坐标，样品质量浓度（mg·L-1）为横坐标，得标准曲线回归方程为C = 0.0371A + 0.0098，相关系数 r=0.9997。如图1。 Abs
1.41.210.80.60.40.200C = 0.0371A + 0.0098R2 = 0.9996浓度mg/L10203040图1 样品标准曲线 2.5 样品测定：精密吸取供试品溶液1.0ml，以法测定吸光度，按回归方程计算绿原酸的质量分数。
2.6 抑菌活性的测定：采用平板法。取各种供试菌悬液各0.2ml，分别注入无菌培养皿内，再倒入15ml琼脂培养基，混匀后冷却成含菌平板。然后将每个平板均分成4等份，每份正中处轻放一无菌牛津小杯，在牛津小杯中注入浓度为30%的金银花提取物的水溶液，每菌作3次重复，然后将培养皿放置培养箱中36℃培养24h，测量每个牛津小杯所对应的抑菌圈直径大小，抑菌圈越大，抑菌活性越好。 3.3 不同提取方法结果比较
3.3.1 不同提取物中绿原酸含量的比较
表 2 金银花不同提取方法结果比较
改良石硫法
水提正丁醇萃取法
乙醇回流提取法
水提醇沉法
绿原酸提取率（%） 绿原酸质量分数（%）
11.404 68.872
18.0 42.834
37.497 94.326
94.681 16.685
由表2可知，以绿原酸提取率为考察对象，水提醇沉法的结果最高，乙醇回流乙酸乙酯提取法次之；而以绿原酸质量分数为考察对象，乙醇回流乙酸乙酯提取法最高，改良石硫发次之。然而改良石硫法，水提正丁醇萃取法和水提醇沉法都是水提的，但是结果却相差甚大，说明在提纯方法上，改良石硫法的提纯工艺是三者之中最好的。但是相比较乙醇回流乙酸乙酯提取法的提纯工艺还是后者比较好。 3.3.2 不同方法提取物的抑菌比较
表 3 抑菌活性的比较( ｘ±ｓ，ｎ=4)
枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌
大肠杆菌 绿脓杆菌
改良石硫法
提 取
水提正丁醇萃取法
方 法
乙醇回流提取法
水提醇沉法
2.41±0.035 2.61±0.025 3.47±0.042 2.72±0.049
2.09±0.020 2.22±0.025 2.60±0.035 2.25±0.050
2.41±0.036 2.42±0.031 2.40±0.020 2.63±0.025
1.90±0.031 1.83±0.021 2.20±0.035 1.91±0.031
由表3可知，在对4种不同致病菌的抑菌比较中，改良石硫法所得到的提取物抑菌效果最好，其次是乙醇回流法得到的提取物抑菌效果好。这与二者之间的绿原酸质量分数比较成反比关系。这可能是因为，改良石硫法在提取绿原酸的同时也提取出其他成分，这些成分与绿原酸相互协同产生很好的抑菌效果。而乙醇回流法所得到的提取物中绿原酸质量分数最高，同时其他产物的质量分数就相对很低，其抑菌效果就相对较低一些。就提取物中绿原酸的质量分数而言，乙醇回流法要比改良石硫法多出30%多，而他们的抑菌效果相比较而言，基本上相差不大。 就综合来说，还是选用乙醇回流法比较好。 3 讨论
在比较不同的提取方法对绿原酸的含量影响，其中以乙醇回流法所得到的提取物中绿原酸质量分数最高，达到94.326%；水提醇沉法虽然得到的绿原酸提取率最高，但是
其所含的杂质也相对较高，提取物中绿原酸的质量分数只有16.685%。
在比较不同的提取物的抑菌效果时，以改良石硫法所得到的提取物抑菌效果最好，其次是乙醇回流提取法所得到的提取物抑菌效果好。我们知道金银花中的抑菌成分主要就是绿原酸，但是在抑菌效果上并没有因为绿原酸的质量分数高，其抑菌效果就好。就像在我们研究中药中出现的情况，中药中单体成分的药用效果并没有整体的效果好，这是因为存在着协同作用。金银花中的抑菌成分并不只有绿原酸。还存在其他化合物。这些成分相互协同就能达到一个很好的抑菌效果。
结合本人在“正交试验优选金银花提取工艺”中所得到的结果综合考虑得到，金银
花抑菌成分最佳提取工艺为：当乙醇体积分数为50%时，提取时间为1小时，物料比为1：10时，其提取物中绿原酸质量分数和抑菌效果皆相对较好。
参考文献
[1]刘祥兰，刘重芳，张英等.金银花中绿原酸提取工艺的比较和优化研究[J].中成药，2000，22（6）：402～404
[2]阎巧鹃，韩鲁佳，江正强.金银花中绿原酸提取纯化工艺的研究[J].中国农业大学学报，2002，7（2）：22～26
[3]陈发奎主编. 常用中草药有效成分含量测定[M].北京. 人民卫生出版社.1997. 425
