含非洲猪瘟病毒核酸序列病毒样颗粒的研制及其在检测方法中的应用

China Animal Husbandry 8 Veterinary Medicine

doi： 10. 131/j. cnki. 1671-7236. 2017. 11. 025

含非洲研

猪制

瘟及

病其

毒在

核检

酸测

序方

列法

病中

毒的

样应

颗用

粒的

冯春燕1，杜方原1，刘丹丹1，P

ershinAndrey2，王彩霞1，张永宁1，吴绍强1，林祥梅

1

(1.中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京100176).俄罗斯联邦兽医研究所，尤里耶韦茨600900)

摘

要

：非洲猪痕（African swine fever，A

SF)是由非洲猪痕病毒（African swine fever virus，ASFV)引起的烈性传

染病，为了保证其检测结果的准确性和可靠性，需要研制试剂盒中使用的阳性标准质控品。本试验旨在研制含

ASFV核酸序列的病毒样颗粒，并探究其在检测方法中的应用。首先扩增力72基因的全长片段，利用昆虫杆状病

毒系统，包装出含有力72基因的ASFDNA病毒样颗粒。为了进一步验证该病毒样颗粒在应用中的可靠性，本研 究将病毒样颗粒与ASF的组织毒及细胞毒同时进行DNA核酸提取，进行实时荧光定量PCR

。

结果表明，本研究

制备的病毒样粒子能很好的取代ASFV在实时荧光定量PCR检测方法中作为阳性质控品，且能对核酸提取过程 进行质控，实时荧光定量PCR检测试剂盒中，病毒样粒子的最低包装浓度为102 TCID50。进一步研究发现该病毒 样颗粒也适用于普通PCR及LAMP检测方法中，最低浓度分别为103和101 TCID50。本试验结果将为规范ASF 检测方法，促进ASF检测方法的转化应用及保证检测结果的准确度和可靠性提供科学依据。

关键词：非洲猪瘟;参考物质;病毒样颗粒；检测方法中图分类号：S852. 65

文献标识码

：A 文章编号：1671-7236(2017)11-3287-07

Development of Virus-like Particles Containing African Swine Fever Virus

Nucleic Acid Sequence and Its Application in Detection Method

FENG Chun-yan1， DU Fang-yuan1， LIU Dan-dan1， Pershin Andrey2， WANG Cai-xia1，

ZHANG Yong-ning1，WU Shao-qiang1，LIN Xiang-mei1

(1. Institute of Animal Quarantine， China Institute of Inspection and Quarantine， Beijing 100176，China)

2. AU-Russia Research Institute of Animal Health， YuryeveSs 600900, Russia)Abstract： African swine fever (ASF) is an infectious disease caused by the African swine fever vi­rus (ASFV). In order to ensure the accuracy and reliability of the test results, it is necessary to develop positive standard control products used in the kit. The study was aimed to develop the vi­rus-like particles containing African swine fever virus (ASFV) nucleic acid sequence and its appii- cation in detection method. Fristly,the full-length gene fragment of p72 genewas amplified，and the ASF DNA virus-like particles containing p72 gene was constructed using insect baculovirus system. In order to further validate the reliability of the virus-like particles in the application of the method,DNA nucleic acid was extracted simultaneously with the cultured virus and infected tissue sample and applied in the Real-time quantitative PCR method. The results showed that the virus-like particles prepared by this study could replace the ASFV as a positive control product in the Real-time quantitative PCR method， and could act as quality control during nucleic acid ex­traction process. In the fluorescent PCR detection kit，the lowest packaging concentration of vi­rus-like particles was 102 TCID50. Further studies had shown that the virus-like particles were al-*

收稿日期：2017-05-24

基金项目：十三五科技支撑计划（2013BAD12B00);国家质检总局科研基金资助项目（2015IK310)

作者筒介：冯春燕（1982-)，女，湖北宜昌人，博士，副研究员，研究方向：动物检疫，E-mail:feIlgcy@caiq.gov.cn*通信作者：林祥梅（1970-)，女，山东莒县人，博士，研究员，研究方向：动物检疫，E-mail:linxm@caiq.gov.cn

3288

中国畜牧兽医

44卷

so suitable for common PCR and LAMP detection methods, the minimum concentration were 103 and 101 TCID5〇 , respectively. The results of this study would be important for the ASF detection method, promoting the application of the method and ensuring the accuracy and reliability of the test results.

Key words： African swine fever (ASF) ; reference substance; virus-like particle; detection methods

非洲猪痕（African swine fever,ASF)是由非洲 猪痕病毒（African swine fever virus, ASFV)引起的 以高热、皮肤发绀、淋巴及内脏器官严重出血为特征 的急性、接触性传染病，一旦暴发，死亡率接近 100%[13]。家猪和野猪是该病毒的自然宿主，感染 后可终身带毒[4-]。ASFV是一种单股、两端共价连 接的双链DNA病毒，具有二十面体结构，基因组全 长约170 101bp,主要由4层组成：核仁、核衣 壳、内层囊膜和二十面体的病毒衣壳，胞外病毒粒子 还有一层外囊膜。目前已发现的结构蛋白有54个， 包括p72、p54、p30抗原蛋白等[7]。ASFV的宿主包 括疣猪、丛林猪、薮猪、家猪和软蜱等，并在ASF的 跨境传播过程中起十分重要的作用。研究表明， ASFV是迄今为止发现的唯一能在昆虫中寄生的

DNA病毒，能在被感染猪的血液、组织液、内脏及排

的重组质粒作为阳性参考物质，这虽然解决了目前 参考物质缺乏的现状，但无法解决对核酸提取过程 进行质量监控的问题[7]，构建含有病毒核酸序列的 病毒样颗粒成为标准物质研究的新方向[16]。本研

究借助杆状病毒系统研制了含有ASFp72核酸序 列的DNA病毒样颗粒，用于ASF荧光病原检测方 法中的阳性参考物质，旨在为进一步规范ASF检测 方法，保证检测结果的准确度和可靠性提供科学 依据。1

材料与方法

sf9细胞和pFast Bac1载体

1.1材料1. 1. 1 细胞及酶

均购自Invitrogen公司；大肠杆菌DHlOBac感受态 细胞购自北京派瑞金生物科技有限公司；T4连接 酶、性内切酶均购自TaKaRa公司；大肠杆菌

DH5-感受态细胞和PCR MO均购自北京全式金

泄物中发现\"10]。此外，还有研究显示，ASFV能在 低温暗室内保存的血液中存活6年，室温中可存活 数周[11]。

中国尚无ASF疫情，但随着猪肉进口贸易的不 断扩大，加上相邻国家俄罗斯疫情频发，国内面临严 峻的防控形势。目前，ASF还缺乏有效的疫苗，疫 情一旦传人，将给国内的养猪业带来难以估量的损 失。建立准确、可靠的检测方法是口岸防控ASF传 人的重要手段。目前，OIE推荐的ASFPCR和实 时荧光定量PCR方法主要检测ASF结构蛋白^72 基因，阳性参考物质的研究对保证检测结果的可靠 性和准确性具有十分重要的意义[1215]。已有的一 些病毒的检测采用传统的核酸片段或含有目标片段1引物信息

Table 1 The primers sequences information

表

引物名称

引物序列

生物技术有限公司。

1.1.2主要仪器 恒温振荡器（THZ-C型）购自太仓市试验设备厂；制冷恒温落地摇床购自Ther­

mo 公司； 生物安全柜购自 Nuaire 公司。

1.2引物设计与合成

根据GenBank中登录的^72基因（登录号：

KX354450. 1)序列，用 Primer Premier5. 0 设计 P2基因特异性引物及鉴定重组病毒M13引物，引

物信息见表1。引物均由ThermoFisher基因公司 合成。

退化温度片段大小

Primer namesP72-Bac-FP72-Bac-RM13 ForMl 3 RevASF-1ASF-2

Primer sequences/(5'&3')CGGAATTCatggcatcaggaggagcCCCTCGAGttaggtactgtaacgcagcGTTTTCCCAGTCACGACCAGGAAACAGCTATGACATGGATACCGAGGGAATAGCCTTACCGATGAAAATGATAC

Annealing temperature/°C

56

Fragmen?leng?h/bp

1 980

56300

56250

11期冯春燕等：含非洲猪瘟病毒核酸序列病毒样颗粒的研制及其在检测方法中的应用

32

1.3 p72基因的扩增及质粒构建

以P72阳性克隆质粒为模板利用引物对P72

，

-

1.7病毒样颗粒的验证及定量试验

将构建的ASFV病毒样颗粒在俄罗斯联邦兽 医研究所（ADRussiaResearch Institute ofAnimal

Health，ARRIAH)与ASF的组织毒及细胞毒进行

Bac-F/p72-Bac-R进行PCR扩增。PCR反应体系

25 模板0.5 上、下游引物各1 #L，2XPCR

Mix12.5 #L，ddH2O10 #L。PCR 反应条件：96°C 比对试验并进行定量。利用QiagenDNA提取试剂 盒提取细胞上清中的ASFV病毒样颗粒的DNA， 参照OIE提供的ASFV的实时荧光定量PCR方法 进行验证。提取ASFV病毒样颗粒及ASF细胞毒 和组织毒的DNA，将细胞毒滴度连续倍比稀释为 预变性 60s;94 °C变性 40s，56 °C退火 60s，72 °C 延伸140 s,共30个循环；72 °C延伸10min。琼脂 糖凝胶电泳鉴定后回收目的片段，将纯化的目的片

段和pFastBac1质粒分别经过£c〇R I和X/w I 酶切后，用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5-感 受态细胞，筛选出阳性克隆p72-pFastBac1。1. 4 重组杆粒Bacmid-p72的构建与鉴定

重组转座质粒pFastBac1-p72转化含有穿梭载 体Bacmid的大肠杆菌DHlOBac感受态细胞中， 37°C、250 r/min 培养 4 h，涂布于含有 X-gal、

IPTG、四环素、卡那霉素及庆大霉素的LB琼脂平

板上，37 C培养48h，经2次蓝白斑筛选并挑取单 个白色菌落于含四环素、卡那霉素、庆大霉素的LB 培养液扩大培养，利用质粒大提试剂盒提取重组杆 粒Bacmid-p72,并以其为模板，用M13引物和p72 特异性引物分别进行PCR鉴定。1.5

病毒样颗粒的包装

将状态较好的Sf9细胞铺于6孔板中（2X106 个/mL)，转染前用s*900 '培养液清洗细胞2遍， 转染时按不同梯度的杆粒浓度分别加人10 #g重组 杆粒Bacmid-p72于100 #L s—900 '培养液中，平 行设立含有6 #L转染试剂的S--900 '培养液为对 照，充分混匀后，室温放置30 min。混合物逐滴加 人sf9单层细胞，27 C培养5 h后弃转染混合液，补 加不含抗生素和血清的s*900 '培养基，27 C继续 培养，3!5 d后收集上清为P1，标记为P1代重组病 毒，同时设空细胞对照。将P1代重组病毒液按1U 的体积分数进行传代，得到P2、P3代重组病毒，收 集上清。20 000 r/min离心20 min,取上清。1.6病毒样颗粒TCID5。的测定

将生长旺盛的sf9单层细胞用新鲜的培养基进 行洗涤，轻轻摇动，用生长液调节细胞浓度为1X 103个/mL，150 #L/孔分装到96孔板中。在37 C、 5U CO2培养箱中培养24h左右，形成单层细胞。 移出培养液，用无菌的Hank’s液（pH7. 2!7. 4)将 病毒10倍倍比稀释成10—1至10—10 (共10个梯 度&每个梯度做4个重复，5 d后观察细胞病变 (CPE)，记录试验结果。

107 TCID5。至 5X102 TCID5。，进行荧光定量 PCR 检测。PCR反应体系25 #L:模板5 #L，2XqPCR 缓冲液12. 5 #L，上、下游引物（OIE-F/OIE-R)各 1#L，ddH2O补足到25#L。PCR反应条件：95 C 预变性2 min;然后采用二步法进行反应：95 C变性 5 s;58 C退火延伸30 s，45个循环。每个循环结束 后采集荧光数据。

1. 8 ASFV病毒样颗粒在普通PCR和LAMP检测 方法中的应用

将梯度稀释的ASFV病毒样颗粒DNA进行普 通PCR检测。PCR反应体系25 #L:模板1 #L，2X

PCR缓冲液12. 5 #L，上、下游引物（ASF-1/ASF-2,

10 mmol/L)各 1 #L，ddH2O 补足至 25 #L。PCR 反应条件！5 °C预变性5 min;95 °C变性45 s，56 °C 退火45 s，72 C延伸1 min，35个循环）2 C再延伸 10 min;4 °C结束 10 min。

将提取的ASFV病毒样颗粒的DNA进行

LAMP 检测[17]。反应体系 25 #L: 10 X Thermopol Buffer 2. 5 #L,100 mmol/L MgSO4 1 #L,2. 5 mmol/L dNTP 8 #L,3. 2 mol/L Betaine 5 #L，ASFF31、AS- FB31(5 #m〇l/L)各 0. 5 #L，ASFFIP1、ASFBIP1

(20 #mol/L)各 1. 2 #L，8 U/#L Bst DNA Poly­

merase 1. 5 #L, 待 检样品 1 #L，ddH2O 补充至

25 #L。将反应管置于实时荧光定量PCR仪中 65C反应50min，每30 s采集1次FAM通道荧光 信号。2

结果

2.1 重组载体P72-PFastBac1的鉴定

利用p72-Bac-F/p72-Bac-R引物对构建的质粒 进行鉴定，结果见图1。由图1可知，在约2 000 bp 处扩增出片段，与预期大小一致（1941bp)，表明已 经成功构建了 p72_pFastBac1的重组载体。

3290

中国畜牧兽医44卷

Ml 1 2 M2M 1 2 3 4

M，Trans2K Plus Marker ；〜3，重PCR

M! Trans2K Marker) !

阴性对照；2，重组质粒卩

鉴定；，阴性对照

组杆粒

Bacmid-p72 的

72-

M?Trans2K Plus Marker ； !-3 ? Identification of recombi­nant Bacmid-p72 ； 4 ? Negative control

pFastBacl;M2，Trans2K PlusMarker

M!Trans2K Marker;! Negative control;2，p72-pFast-Bacl recombinant plasmid； M2 ?Trans2K Plus Marker

图1 重组载体p72-pF*stBacl的鉴定

Fig. 1 Identification of p72-pFastBac1 recombinant vector2.2 重组杆粒Bacmid-P72的鉴定

在三抗培养基中挑取3个白斑和！个蓝斑，利 用M13引物进行鉴定，结果见图2*由图2可知，在 约'399 bp处出现了一条特异性条带，与预期大小 一致，表明了 p72质粒成功整合到Bacmid中。而在 蓝斑克隆中，并没有发生p72的重组，M13扩增大小为300 bp。

图2 重组杆粒Bacmid-p72的鉴定

Fig. 2 Identification of recombinant Bacmid-p722G

重组杆粒Bacmid-p72转染sf9昆虫细胞的病

毒包装及细胞病变

由图3可知，重组杆粒Bacmid-p72转染sf9昆 虫细胞3 d后，与对照组相比，转染了重组杆粒Bac-

mid-p72的细胞生长停止，细胞变大，细胞内出现颗

粒状物质，单层细胞漂浮。CPE结果显示，收集的

P2代病毒滴度为！07 TCID5〇。

图3细胞感染前（A)和感染后（B)的细胞形态学变化（20X)

Fig. 3 The morphological changes of sf9 celSs before (A) and after infection (BX20X )2.4 ASF假病毒的验证和定量

通过与俄罗斯联邦兽医研究所合作，将本研究 制备的ASFV病毒样颗粒与该实验室保存的ASF 细胞毒和组织毒进行比较验证及定量。当细胞培养 毒滴度范围为！07 TCID5。至5 X !02 TCID5。时，Ct值

为！2. 29〜28. 44,由此得出ASF细胞毒的细胞滴 度与Ct值的线性关系为：y= — 3. 7355x+39. d'，

R2 =0. 9861(图4)。根据上述病毒滴度与Ct值之

间的线性关系，分别计算出病毒样颗粒及病料组织 中病毒的滴度。

11期冯春燕等：含非洲猪瘟病毒核酸序列病毒样颗粒的研制及其在检测方法中的应用

3291

35 03 25 0 2

由表2可知，A S F组织毒的测算滴度可以达到 106#4TCID5Q。对病毒样颗粒的测算滴度为106#4

TCID5。，而利用<9昆虫细胞对病毒样颗粒的滴度

a1 5

n

0^1 A 5»5

进行测定，结果显示病毒滴度为10+ TCID5〇。随着 病毒滴度的稀释，对于制备的ASFV病毒样颗粒， 测算的病毒滴度与<9细胞试验测定的病毒滴度的 差距逐渐缩小。病毒稀释105倍后，试验测定的滴 度为102 TCID5。，测算的病毒滴度为102#9 TCID5。。

〇-------1-------1-------1-------1—

2. 00

4. 00

LgTCID5〇

6. 00

8. 00

图4 ASF细胞毒的细胞滴度与Ct值的线性关系

Fig. 4 The linear relationship between cell titer and Ctvalue of ASF cytotoxicity

表2 ASF组织毒和病毒样颗粒的Ct值及测算的滴度Table 2 Incidental rates and estimated titers of infected tissue and virus-like particles of ASFV

名称

lgTCID.

测算滴度

C?

测算滴度

名称C?

试验滴度

NamesITS-1ITS-2ITS-3ITS-4ITS-5ITS-6ITS，组

织毒；V

Measure?t?er

14. 4317. 3220. 5923. 5926. 8130.56LP，ASFV

病毒样颗粒

NamesVLP-1VLP-2VLP-3VLP-4VLP-5VLP-6

16.3119.51

22.10

Experimental titer

7

6

Measure?t?er

6. 14

6.5.885.014.223. 372.38

5.304. 613. 662. 922. 19

543

2

25.7328.5131.29

ITS，Infected tissue sample ;VLP，ASFV virus-like particles

2.5 ASFV病毒样颗粒在检测方法中的应用 2.5.1普通PCR

由图5可知，利用OIE推荐

M

1

2

的引物能扩增出250 bp左右的目标片段，病毒能被检测出来的浓度为102 TCID50。

3

4

5

6

bp

250

100

MM

，DL2000 D，DL2000 D

NA Marker)〜5，病

毒样颗粒滴度分别为

105、104、103、102、101TCID50 ;6

,阴性对照

NA Marker;1-5，The titerwere 105，104，103，102 and 101TCID50，respectively;6，Negative control

图5 ASFV病毒样颗粒在普通PCR中的应用

Fig. 5 Application of ASFV virus-like particles in PCR detection method

3292

中国畜牧兽医''卷

2.5.2 LAMP 利用稀释的ASFV病毒样粒子 ASF的LAMP检测方法比较灵敏，能检测到1°°TCID5°的病毒样颗粒。

DNA进行LAMP试验，结果显示，当P2代ASFV

病毒样颗粒的DNA被稀释1°f7倍，即滴度为1°°

TCID5°时，检测结果仍然显示为阳性（图6)。可见，

7

52|«菊

6543210

6 ASFV病毒样颗粒在LAMP检测方法中的应用

Fig. 6 Application of ASFV virus-like particles in LAMP detection method

图

该标准品的研制解决了目前ASFV核酸检测中病

3

讨论

ASF是一种外来烈性传染病，做好检疫把关是

毒样颗粒标准品缺乏的现状。更重要的是，本研究

制备的ASFV病毒样颗粒能对核酸提取过程及提 取试剂进行质量控制，保证了检测结果的准确度和 可靠性。进一步的验证试验结果显示，制备的参考 物质在OIE推荐的普通PCR检测方法中建议包装 滴度％1°3 TCID5°，实时荧光定量PCR中建议滴度 为％1°2 TCID5°，在LAMP方法中，建议包装滴度 为％1°! TCID5°，为后期试剂盒的研发提供了参考。%

结论

本研究研制了含有ASF核酸片段的病毒样颗 粒，进一步与ASF野生毒和细胞毒进行比较试验， 表明了该病毒样颗粒适合用于检测试剂盒中作为参 考物质，并确定了检测试剂盒使用中的最小包装浓 度。同时该病毒样参考物质适用于ASF实时荧光 定量PCR、普通PCR及LAMP检测方法中。本研 究不仅为ASF检测提供了有效的参考物质，进一步 为其他DNA疫病检测过程中阳性参考物质的制备 提供了新的思路。

致谢：感谢俄罗斯联邦兽医研究所的工作人

员在非洲猪瘟病毒样粒子参考物质的验证中提供的帮助。

目前防止其传入的重要手段。阳性标准物质是试剂 盒提供准确可靠的检疫结果的重要保障。受生物安

全操作的，早期很多DNA病毒在检测过程中 主要使用合成的基因片段或重组质粒作为标准 品[17]。这些标准品主要用于核酸检测方法的质量 控制，无法对样品处理及核酸处理过程的操作进行 质量控制。ASF检测中使用的标准物质需要满足3 个条件：安全、具有DNA病毒的结构及含有ASF 的参考序列。而病毒样颗粒由于其安全稳定，具有 病毒结构等特点，成为目前参考物质的最佳选择之一 [18—19]

与ASFV —样，杆状病毒也是DNA病毒，该病 毒对动物没有危害，广泛用于实验室研究中[2°22]。 利用杆状病毒表达系统在sf9细胞中包装出的含有 非洲猪瘟力72基因的病毒样颗粒，满足了参考物质 所需的3个条件。同时，ASFV病毒样颗粒还具有 一些杆状病毒的特征[23]，如能在'°C条件下保存半 年以上、安全性高、外源基因容量大、易于筛选等特 点，其不仅局限于实验室的检测使用中，也适合于试 剂盒的应用中。

本研究利用俄罗斯联邦兽医研究所的研究条 件，将研制的ASF病毒样颗粒与ASF阳性病料及 其细胞毒进行同步提取，比较了它们在荧光PCR检 测方法中的差异。结果显示，本研究研制的ASFV 样颗粒可以取代阳性病料作为检测试验的标准品。

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(责

任编辑姚倩倩）