黑曲霉产α2转移葡萄糖苷酶固态发酵条件优化

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第24卷第2期食品与生物技术学报Vol.24　No.2　　　　　　　　　　　　　　2005年3月Mar.　2005JournalofFoodScienceandBiotechnology文章编号:1673216(2005)0220065204　

毕金峰1,　魏宝东2,　李长彪2

(1.中国农业科学院农产品加工研究所,北京100094;2.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳110161)

摘　要:对产α2转移葡萄糖苷酶的黑曲霉U菌株固态发酵条件进行了优化.结果表明:麸皮和水

的质量比为1∶1较好,35℃培养48h时产酶量及酶活较高;U菌株生长的最适pH值为610;麸皮中的碳源和氮源可以满足该菌株产酶的需要,可以不外加碳源和氮源.关键词:α2转移葡萄糖苷酶;黑曲霉;固态发酵中图分类号:TQ920.1

文献标识码:A

StudiesonSolid2StateFermentationConditionsforProducingα2TransglucosidasefromAsp.nigerBIJin2feng1,　WEIBao2dong2,　LIChang2biao2

(1.InstituteofFoodScienceandTechnology,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100094,China;2.CollegeofFoodScience,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China)

Abstract:Alpha2transglucosidaseisacriticalenzymeforproducingisomaltooligosaccharide.Thesolid2statefermentationconditionsforproducingα2transglucosidasefromAsp.nigerUwerestudied.Theoptimumconditionsforfermentationinsolid2statewere:bran:water(m/m)=1∶1,culturetemperatureanddurationwere35℃and48hrespectively,theoptimumpHvaluewas6.0.Additionofcarbonandnitrogensourcesintotheculturemediumofbranwasnotrequired,asthecarbonandnitrogensourcesinbrancouldsatisfytheneedsfortheenzymeproduction.Keywords:α2transglucosidase;Asp.niger;solid2statefermentation

α　　2转移葡萄糖苷酶(α2transglucosidaseE.C.

2.4.1.24)又称α2葡萄糖苷酶(α2glucosidaseE.C.3.2.1.20),它可以从低聚糖类底物的非还原性末端切开α21,4糖苷键,释放出葡萄糖,或将游离出的葡萄糖残基以α21,6糖苷键转移到另一个糖类底物上,从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖(以下简称IMO,主要包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等)、糖脂或糖肽等.该酶既具有水解能力,又具有转移能力,故对其命名说法不一[1～3].α2转移葡萄糖苷酶在自然界中分布广泛,种类繁多,性质各异,几乎存在

　　收稿日期:2004204220;　修回日期:2004209203.

于所有生物体内,在人类的糖原降解及动物、植物

和微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能.它作为工业化生产IMO的关键酶制剂倍受国内外食品工业界的重视[4,5].与国外相比,我国的研究工作还处于起步阶段,主要集中在α2转移葡萄糖苷酶生产菌株的筛选方面,对于其性质、化学结构、催化机制等方面的报道较少.目前,国外生产的α2转移葡萄糖苷酶大部分为纯酶,国内研究主要以粗酶液为主.作者在选育出高产α2转移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株基础上,对黑曲霉固态发酵条件进行了优化研

作者简介:毕金峰(19702),男,吉林辉南人,副教授,农学博士,博士后.

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究,确定了最佳产酶条件,为该酶的分离提纯、酶学性质研究及国产化提供理论依据[6～9].

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　菌种　作者所在实验室经诱变选育的高产

α2转移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株U.

1.1.2　培养基

1)斜面培养基(PDA):马铃薯去皮、切碎,称取200g,切成条或块,加水1000mL,煮沸30min,双层纱布过滤,取滤液,用水补足至1000mL,加葡萄糖50g,琼脂20g,pH值自然.

2)固体麸皮培养基:麸皮(沈阳市东大面粉厂生产),水,营养物.1.2　主要仪器

HZQ2F160全温振荡培养箱:哈尔滨市东联电

图1　U菌株形态(右)(40×16)

Fig.1　MorphologyofstrainU(right)(40×60)

2.2　麸皮加水量对产酶的影响

在10g干麸皮中分别加入5,10,15,20,25mL

蒸馏水,用玻璃棒搅匀,密封后于60℃水浴锅中保温1h,并于121℃灭菌60min,冷却.接种U菌株孢子悬浮液0.5mL于5个不同处理中,用玻璃棒搅匀后置于35℃下培养48h.准确称取培养好的麸曲3g,加入30mL蒸馏水,室温浸泡6h,4℃于5000r/min离心20min,取上清液作为粗酶液.取5mL具塞刻度试管若干,分别加入1mL20g/dL麦芽糖、1mLpH5.4的缓冲液,在55℃水浴锅中保温5min后,加入上述不同处理的酶液1mL,反应1h后灭酶(沸水浴中5min),测定不同处理的相对酶活,结果见图2.可知该菌在加入10,15mL水时,固态培养菌所产酶的酶活较高,观察发现菌丝生长状态良好,确定最佳麸皮和水的质量比为1∶1.

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1.3.1　相对酶活测定方法　国际酶学委员会规定:在一定条件下(pH值、温度、离子强度等),1min内将1μg分子的底物转化为产物的酶量定为一个国际单位(I.U.).用直接滴定法测定α2转移葡萄糖苷酶作用于一定浓度的底物(麦芽糖)生成产物还原糖的量,用消耗反应液体积来间接反映α2转移葡萄糖苷酶的酶活,即相对酶活.通过试验证明用直接滴定法测还原糖所消耗的酶反应液体积(以下简称耗糖体积)来反映酶活与定量测定结果趋势一致.说明耗糖体积越多,反应液中还原糖含量越低,则在单位时间内α2转移葡萄糖苷酶水解底物(麦芽糖)的能力越差,即相对酶活越低;反之相对酶活越高.1.3.2　还原糖测定方法　直接滴定法[10].

图2　加水量对相对酶活的影响

Fig.2　Effectofwaterquantityonrelativeenzymeac2

tivity

2.3　麸皮pH值对产酶的影响

配制不同pH值的磷酸氢二钠2柠檬酸缓冲液,

称取麸皮10g,加入不同pH值的缓冲液10mL,其他操作同2.2,测定不同处理的相对酶活,结果见图3.可知U菌在pH值6.0时产酶酶活较高.定期观

2　结果与分析

2.1　U菌株形态观察

U菌株菌丝较短,白色,成熟时孢子呈棕褐色,

察菌株生长状况时发现,在此pH值条件下生长状

况良好.2.4　培养温度对菌株生长及产酶的影响

称取麸皮10g,按质量比为1∶1的比例加入水,其他操作同2.2.于不同温度下进行固态发酵试验,酶反应结果见图4.可知35℃是该菌的最佳产

较小,在显微镜下观察结果见图1.

　第2期毕金峰等:黑曲霉产α2转移葡萄糖苷酶固态发酵条件优化

酶温度.定期观察菌株生长状况时发现,30℃和35℃处理时菌体生长状况良好.

泡,在不同时间离心取酶液,并测定酶活,结果见图7.可知室温浸提6h时即获得较高酶活,浸提时间

延长到24h时,酶活未见明显提高,浸提时间过长,

可能引起霉菌的二次生长,导致酶活降低.因此,选择室温浸提6h即可.

图3　pH值对相对酶活的影响

Fig.3　EffectofpHvalueonrelativeenzymeactivity

图6　培养时间对相对酶活的影响

Fig.6　Effectofculturetimeonrelativeenzymeactivity

图4　温度对相对酶活的影响Fig.4　Effectoftemperatureonrelativeenzymeactivity2.5　接种量对产酶的影响在10g麸皮中分别加入9.75,9.5,9.0,8.0,

6.0mL蒸馏水,水浴、灭菌,对应接种孢子菌悬液0.25,0.5,1.0,2.0,4.0mL,35℃培养48h,在同

图7　浸提时间对相对酶活的影响

Fig.7　Effectofextractingtimeonrelativeenzymeactivity

2.8　外加碳源对产酶的影响

一条件下制取酶液,进行酶反应,结果见图5.U菌株接种量超过1mL时,酶活差别不显著,确定1.0mL为最佳接种量.

配制5g/dL的不同碳源.称取10g麸皮,分别加入上述配好的溶液10mL.每种碳源两瓶,一瓶接种U菌株,一瓶对照(CK1).在相同条件下培养菌株,制取酶液,进行酶反应,结果见表1.同时做不外加碳源的接种(CK2)对照,其耗糖体积为7185mL.可知外加碳源但未接种的对照间差别不显著,

只有葡萄糖的还原能力略高些.不同外加碳源对产酶的影响较小,外加葡萄糖碳源的相对酶活略高些,但因葡萄糖本身还原能力也较强,因此最终结

图5　接种量对相对酶活的影响

Fig.5　Effectofinoculationvolumeonrelativeenzyme

activity

果无太大差异.外加碳源与未外加碳源的处理差别不显著.从生产成本上考虑,以麸皮作培养基,可不外加其他碳源,但当大规模生产时可适量加入.

表1　外加碳源对相对酶活的影响

Tab.1　Effectofcarbonsourcesonrelativeenzymeactivity

2.6　最佳培养时间试验

当麸皮和水的质量比为1∶1,接种量为1mL

时,定期观察菌株生长状况,并定期取样制取酶液,进行酶反应,结果见图6.培养48h时,U菌已长出孢子,菌丝体量达到最大值.酶活测定结果表明,培养48h时,酶活已经较高,确定最佳培养时间为48h.2.7　浸提时间对产酶的影响

麸皮和水的质量比为1∶1,接种量为1mL,35℃培养48h.按1g菌体加入10mL无菌水室温浸

碳源蔗糖麦芽糖葡萄糖淀粉可溶性淀粉

耗糖体积/mL

CK115.1015.1014.6515.5015.75

接种

7.857.807.757.907.80

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活较高,几个质量浓度的处理均好于不外加氮源的对照.但牛肉膏价格昂贵,不利于降低生产成本.因

测试结果与对照差异不显著,固体麸皮培养基中可不外加氮源,大规模生产时可寻找廉价氮源.

表2　外加氮源对相对酶活的影响

Tab.2　Effectofnitrogensourcesonrelativeenzymeactivity

2.9　外加氮源对产酶的影响

配制3g/dL的不同氮源,取不同氮源溶液10

mL,加入到10g麸皮中,灭菌接种,定期观察结果,并进行产酶分析,结果见图8.

氮源牛肉膏酵母膏蛋白胨

1.牛肉膏;2.尿素;3.L2谷氨酸;4.蛋白胨;5.酵母膏;6.氯化铵;7.铵;8.硫酸铵;9.磷酸氢二铵;CK.未加

U(1g/dL)8.839.009.05

耗糖体积/mLU(3g/dL)U(5g/dL)

8.808.908.90

8.809.158.87

氮源处理.

3　结　论

1)诱变选育出一株产α2转移葡萄糖苷酶酶活

图8　外加氮源对U菌株相对酶活的影响

Fig.8　Effectofnitrogensourcesonrelativeenzymeac2

tivityofstrainU

　　由图8看出,U菌株在1,4,5号外加氮源上生长较好,产酶酶活较高.因此选择牛肉膏、蛋白胨、

酵母膏3种氮源,用1,3,5g/dL3个质量浓度进一步做氮源试验,结果见表2.CK为加水试验,其耗糖体积为9110mL.可知不同质量浓度的外加氮源对菌株的影响不同.U菌株在牛肉膏中生长良好,酶

较高的黑曲霉—U菌株,其固体培养方式产酶酶活明显高于液体培养方式,所产酶属于细胞外酶.

2)固态发酵产酶条件优化结果表明,麸皮和水的质量比为1:1较好,35℃培养48h时产酶量及酶活较高,U菌株生长的最适pH值为6.0,麸皮中的碳源和氮源可以满足该菌株产酶的需要,可以不外加碳源和氮源.

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(责任编辑:李春丽)

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