维普资讯 http://www.cqvip.com 第２４卷第２期 河南科学 Ｖ０ｌ，２４ Ｎｏ．２ ２００６年４月 ＨＥＮＡＮ ＳＣＩＥＮＣＥ Ａｐｒ．２００６ 文章编号：１００４—３９１８（２００６）０２－０２２６－０４ 月季切花内源激素含量ＥＬＩＳＡ测定方法的建立 毕会涛・，郑根宝・，冯建灿 ，钟显 ， 胡春瑞 ， 李忠喜 （１．河南农业大学，郑州４５０００２；２．河南省林业技术推广站，郑州４５００００） 摘要：ＥＬＩＳＡ法测定植物内源激素含量具有专一．快捷等特点．介绍了ＥＬＩＳＡ法测定月季切花内源激素含量的 具体步骤，建立了测定月季切花内源激素含量的ＥＬＩＳＡ方法． 关键词：月季；切花；内源激素；酶联免疫吸附法 中图分类号： Ｓ ４８２．８ 文献标识码：Ａ 植物激素是植物体内产生的一类微量活性物质，一般含量很低，为组织鲜重的１０ －１０ 左右［１］．在许多 生理生化研究中，需要对植物激素进行快速、准确的测定．对切花内源激素含量变化进行研究与分析，以期 揭示切花瓶插后代谢机理及不同保鲜剂处理后的切花保鲜机理，近年来已经引起许多学者的注意ｔ２１ １４］． 进行植物激素的测定方法有多种：大致有早期简单的小麦胚芽鞘切段伸长法［５］、对样品纯度要求较高，设 备要求也较高的高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）和色谱一质谱联用法（ＧＣ—ＭＳ）［６ｌ７＿、利用某种分子相同的标记激素（抗 原１和非标记的抗原与专一性的抗／ｉｆｋ（Ａｂ）￣行竞争性抑制反应的放射免疫法（ＲＩＡ）［８］及用酶代替放射性同位 素做标记物的酶联免疫测定法【１］．其中酶联免疫吸附法（Ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙｓ，简称ＥＬＩＳＡ 法）应用于植物激素的测定具有前处理简便、测定快捷、灵敏度好、特异性高的特点，适用于大批样品的测定， 目前广泛应用于植物激素的研究测定（除Ｅｔｈ外）和临床医学等其它方面的检测［９Ｔ１ ｏ】． 月季切花（Ｒｏｓａ ＣＶＳ．）为世界著名的四大切花之一，在月季切花瓶插后代谢机理及保鲜剂处理后的切花 保鲜机理方面，已经取得了一系列的成果．但在月季切花内源激素的ＥＬＩＳＡ测定上，目前尚缺乏具体的、有 针对性的ＥＬＩＳＡ测定具体实验条件的报道，为此，有必要对月季切花内源激素的ＥＬＩＳＡ测定实验条件进行 总结． １基本原理 ＥＬＩＳＡ可分为两类：一是直接竞争法（固相抗体型），即游离抗原和酶标抗原与吸附抗体的竞争结合；二 是间接法（固相抗原型），即游离抗原和吸附抗原与游离抗体的竞争结合．加入酶的底物显色后，显色颜色深 浅与酶的数量成正比，与标准抗原或未知抗原数量成反比．用Ｈ ｓ０ （或者ＫＯＨ）终止反应，在酶联免疫测定 仪上于波长４９０ｎｍ处测定各孔的光密度值（０Ｄ）．绘制标准曲线或进行曲线模拟即可计算出各样品某种激 素的含量． ２试剂材料与样品前处理 ２．１试剂准备 （１）包被缓冲液：称取１．５ｇ Ｎａ ＣＯ ，２．９３ｇ ＮａＨＣＯ３，０．２ｇ ＮａＮ３（可不加），用量筒加１０００ｍｌ蒸馏水，ｐＨ 为９．６． （２）磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）：称取８．０ｇ ＮａＣ１，０．２ｇ ＫＨ２ＰＯ４，２．９６ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４－１２Ｈ２０，用量筒加１０００ｍｌ蒸馏 水，ｐＨ为７．５． （３）样品稀释液：１００ｍｌ ＰＢＳ中加０．１ｍｌ Ｔｗｅｅｎ一２０，０．１ｇ明胶（稍加热溶解）． （４）底物缓冲液：称取５．１０ｇ Ｃ６ＨＢ０７￣Ｈ２Ｏ（柠檬酸），１８．４３ｇ Ｎａ２ＨＰＯ ・１２Ｈ２０，溶解定容至１０００ｍｌ，再加 ｌｍｌ Ｔｗｅｅｎ一２０，ｐＨ为５．０． 收稿日期：２００５—１１－１２ 基金项自：国家林业局９４８项目（２００４１４７） 作者简介：毕会涛（１９７０一），男，河南汝州人，河南农业大学讲师，博士生． 通讯作者：冯建灿（１９６２一），男，河南新密人，河南农业大学教授，博导． 维普资讯 http://www.cqvip.com ２００６年４月 月季切花内源激素含量ＥＬＩＳＡ测定方法的建立 ——２２７—— （５）洗涤液：１０００ｍｌ ＰＢＳ加ｌｍｌ Ｔｗｅｅｎ一２０． （６）终止液：２ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４． （７）提取液：８０％甲醇，内含１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＢＨＴ及２％的ＰＶＰ． ｆＢＨＴ：二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂；ＰＶＰ： 聚乙烯吡咯烷酮，用于除去样品中酚类物质的干扰，ＢＨＴ及ＰＶＰ均先用甲醇溶解，再配成８０％的浓度） （８）激素包被抗原、各激素抗体、标准物和辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗兔抗体（酶标二抗）．目前 此试剂已经有进口及国产的试剂盒出售，大大方便了ＥＬＩＳＡ测定．进口的试剂盒厂商如ｓｉｇｍａ公司，国产 的如中国农业大学及南京农业大学等科研机构均可提供试剂盒服务．购买到的抗原、抗体、二抗及标准物 般在一２０℃下保存． ２．２样品的采集与前处理 ２．２．１采样取不同处理，不同部位的月季鲜切花，用１／１０００精度以上的天平准确称重１ｇ左右（鲜重波动以 在±０．１ｇ范围内为宜，否则将影响到后续的ＯＤ值测定．若取样后材料不能马上测定，可包装、编号后用液氮 速冻１０～１５ｍｉｎ，在一６０℃以下的低温冰箱中保存）． ２．２．２研磨及提取加２ｍｌ样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入１０ｍｌ试管，再用２ｍｌ提取液分次将研 钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在４℃冰箱中提取． ２．２．３离心去． ４￣Ｃ冰箱中提取１０ｈ左右，冷冻离心１５ｍｉｎ（４％，４０００ｒｐｍ），取上清液，记录上清液体积，残渣弃 激素提取液样品中存在的叶绿素等色素干扰物质须通过Ｃ 。萃取柱（５ｍ１）去除．具体步 ２．２＿４样品纯化骤为：８０％甲醇（１ｍ１）平衡柱 取上清液１ｍｌ上样萃取＿＿＋收集样品． （上清液不必全部萃取过柱，由此可节 约ｃ 。萃取柱数量并保证实验结果的ＯＤ值） Ｃ 固相萃取柱经洗柱后可以循环利用１０次左右．具体步骤为：移开样品后用１００％甲醇（５ｍ１）洗柱一 １００％乙醚（５ｍ１）洗柱 １００％甲醇（５ｍ１）洗柱 循环利用． ２．２．５氮气吹干过柱后的样品于４０％水浴下用氮气吹干，为了集中测定方便，吹干后样品可保存在一２０％ 以下的低温冰箱中．在此条件下吹干后样品可保存半年左右． ２．２．６定容用样品稀释液１．５ｍｌ定容，混匀后待测．定容后的样品应尽快测定，一般４＂１２下只能放置一周． ３样品测定 ＥＬＩＳＡ法测定植物激素多为间接法，这里仅以ＡＢＡ的间接测定法为例： ３．１包被在１０ｍｌ包被缓冲液中加入一定量的ＡＢＡ包被抗原（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀，在酶 标板每小孔中加１００￣１．然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，置于３７℃烘箱内温育３ｈ． ３．２洗板将包被好的板取出，放在室温下平衡。然后甩掉包被液，将广口瓶内的洗涤液通过乳胶管均匀 加入板上，使每孔充满洗涤液，放置约０．５ｍｉｎ，再甩掉洗涤液．重复３次，将板内残留洗涤液在吸水纸ｔ甩干． ３．３竞争即加标准物、待测样和抗体． 加标样及待测样：取样品稀释液０．９８ｍｌ，内加２０＆ｌ激素的标样试剂（１００￣ｇ，／ｍ１），即为２０００ｎｇ／ｍｌ标准液， 然后再将２０００ｎｇ／ｍｌ标准液依次稀释为１０００ｎｇ／ｍｌ，５００ｎｇ／ｍｌ，２５０／ｎｇ／ｍｌ，１２５ｎｇ／ｍｌ＂．，０ｎｇ／ｍ１．将系列标准样加 入９６孔酶标板的前三行，每个浓度加３孔，每孔５０ １，其余孔加待测样，每个样品重复三孔，每孔５０ Ｉ． 加抗体：在５ｍｌ样品稀释液中加入一定量的抗体（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀后每孔加５０ ｌ，然 后将酶标板加入湿盒内开始竞争． 竞争条件３７℃左右０．５ｈ．（ＧＡ４为３７℃、１７分钟） ３．４洗板方法同包被之后的洗板．操作中要注意防止各孔的交叉反应． ３．５ ａｎ＿－抗将一定量的酶标羊抗兔抗体，加入１０ｍｌ样品稀释液中（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀 后，在酶标板每孔加１００￣１，然后将其放入湿盒内，置３７℃下，温育０．５ｈ． ３．６洗板方法同包被之后的洗板（步骤３．２），洗５次； ３．７加底物显色 称取１０—２０ｍｇ邻苯二胺（ＯＰＤ）溶于１０ｍｌ底物缓冲液中（小心勿用手接触ＯＰＤ），完全溶 解后加２￣４￣１ ３０％Ｈ．２０ ．混匀，在每孔中加１００￣１（在暗处操作），然后放入湿盒内，当显色适当后（０ｎｇ／ｍｌ孑Ｌ 与２０００ｎｇ／ｍｌ孔的０Ｄ差值为１．０左右时），每孔加入５０ ｌ ２ｍｏＦＬ硫酸终止反应． 维普资讯 http://www.cqvip.com ——２２８—— 河南科学 第２４卷第２期 ３．８ 比色 用２０００ｎｇ／ｍｌ浓度孔（即标准曲线最高浓度孔）调０，在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物 各浓度和各样品４９０ｎｍ处的显色ＯＤ值． 其他激素例如ＣＴＫ、ＺＲ的测定方法与ＡＢＡ测定方法类同．ＧＡ 与ＩＡＡ在定容前需进行样品的甲酯化 工作．甲酯化步骤为：（１）重氮甲烷的制各：取两只试管Ａ和Ｂ，在Ａ管中加入４０％（Ｗ／Ｖ）ＫＯＨ，数量为ｌｍｌ，５ｍｌ 乙醚和５００ｍｇ亚硝基甲基脲，冰浴．待上层乙醚呈黄色，吸取上层入Ｂ管，加入数粒ＫＯＨ．亚硝基甲基脲致 癌，操作时应注意安全．以上操作必须在通风橱中进行． （２）甲酯化：取上述氮气吹干（步骤２．２．５）并用 １００％甲醇溶解的样品５００￣１，加过量重氮甲烷至样品呈黄色，反应１０ｍｉｎ后，加２滴０．２Ｍ乙酸乙醇破坏过量 的重氮甲烷，用氮气吹干． ４结果计算与分析 用于ＥＬＩＳＡ结果计算最方便的是Ｌｏｇｉｔ曲线．曲线的横坐标用激素标样各浓度（ｎｇ／ｍ１）的自然对数表 示，纵坐标用各浓度显色值的Ｌｏｇｉｔ值表示．Ｌｏｇｉｔ值的计算方法如下； Ｌｏｇｉｔ（Ｂ／Ｂ。）＿ｌＴｌ １５１１５０ －ｌｎ啬 其中Ｂｎ是０ｎｇ／ｍｌ孔的显色０Ｄ值，Ｂ是其它浓度的显色值． 做出的Ｌｏｇｉｔ曲线在检测范围内应是直线．待测样品可根据其显色值的Ｌｏｇｉｔ值从图上查出其所含激 素浓度（ｎｇ／ｍ１）的自然对数，再经过反对数即可知其激素的浓度（ｎｇ／ｍ１）． 另外，也可用激素标样各浓度值（ｎｇ／ｍ１）与对应各浓度显色值的曲线模拟方程（依笔者经验，一般为三次 曲线的拟合度最高）代替Ｌｏｇｉｔ曲线，求得样品激素的浓度．一般来说，二种方法求得的结果会略有差异． 由曲线模拟可以迅速得出准确的浓度值，但其应用前提应该建立在所做的Ｌｏｇｉｔ曲线在检测范围内是直线 （或近似直线）的基础上．否则易掩盖操作不熟练造成的误差． 求得样品中激素的浓度后，样品中激素的含量（ｎｇ・ｇ ＦＷ）可用下式计算： Ａ＝ 其中，Ａ表示激素的含量（ｎｇ・ｇ—ＦＷ）；Ｖ 表示提取样品后，上清液的总体积；Ｖ 表示进行氮气吹干的上 清液体积；（当提取的上清液全部进行氮气吹干时Ｖ 与Ｖ：的体积相等，本文中Ｖ ＝ｌｍ１）；Ｖ３表示氮气吹干后 用样品稀释液定容的体积；ｗ表示样品的鲜重；Ｎ表示样品中激素的浓度（ｎｇ／ｍ１）；Ｂ表示样品的稀释倍数 （测定结果落在Ｌｏｇｉｔ标准曲线线性范围内时的样品稀释液定容体积与原始样品稀释液定容体积之比）． ５结论及讨论 ５．１结论 据我们实验室的测定经验，在保证操作无误的基础上，依据以上实验条件定容后的样品在测定ＯＤ值时 大多能实现第一次测定的测定结果即落在Ｌｏｇｉｔ标准曲线的线性范围之内，仅少数样品需要继续稀释以测 定ＯＤ值．由此保证了较好的测定效果，同时大大节约了实验开支． ５．２讨论 ５．２．１激素提取液中是否存在干扰物质的判断和去除通常用以下几个质量控制试验来判断提取液中是 ｌ台存在干扰物质： ①稀释试验，即将样品提取液做一系列稀释，进行ＥＬＩＳＡ测定，所获得的剂量反应曲线应与标准曲线平 行，或者说测定值与稀释倍数相对应，例如做１０倍稀释，则测定值应是原值的１／１０，若差异太大，表明有干 扰物存在． ②平行试验，即将样品提取液定量加入系列浓度的标准物之中，进行ＥＬＩＳＡ测定，所得出的标准曲线应 与不加样品液的标准曲线平行，否则可以断定有干扰物存在． ③回收率试验，将样品分为完全等量的两份，一份加入已知量的标准激素，另一份做对照，进行提取测 定，两个测定值之差与加入值之比即为回收率，若回收率过低或者超过１００％，也说明有干扰物存在． ④仪器法校正试验，ＥＬＩＳＡ测定的样品量极微，而且样品纯度要求比仪器法要低得多，因而用通常的气 维普资讯 http://www.cqvip.com Ⅲ ２００６年４月 嘲 嘲 一２２９一 月季切花内源激素含量ＥＬＩＳＡ测定方法的建立 谱或液谱法难以对ＥＬＩＳＡ作出校正，目前用高分辨率的气质联机（ＧＣ—ＭＳ）可以对ＥＬＩＳＡ测定做出校正和适 当的评价． 样品中存在的干扰物 富有色素、酚类物质等．酚类物质可用可溶性与不可溶性ＰＶＰ（聚乙烯吡咯烷酮）除去， 可溶性ＰＶＰ可直接溶于样品提取液中，不溶性ｐｖＰｕ￣－在研磨时加入．一般材料加入ＰＶＰ在Ｏ一１００ｒａｇ＂ｇ－－Ｆｗ 左右即可达理想效果．叶绿素等色素可通过将激素提取液过Ｃ 预处理小柱去除．（如前２．１及２．２所述） ５．２．２关于影响ＥＬＩＳＡ测定结果的两个问题 ①线性检测范围，指Ｌｏｇｉｔ标准曲线中的线性测定范围．在样品测定过程中，应选择合适的稀释倍数， 使测定结果落在Ｌｏｇｉｔ标准曲线的线性范围之内．若测定结果落在Ｌｏｇｉｔ标准曲线的线性范围之外，则需进 行逐步稀释以确保测定结果落在Ｌｏｇｉｔ标准曲线的线性范围之内，否则易引起较大的浓度估计误差． ②交叉反应，是指抗体与被测定激素以外的物质所起的反应．在样品测定过程中，要注意与抗体有较 高交叉反应的物质，并尽量将其在提取液中排除． 参考文献： 吴颂如，陈婉芬，周燮．酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）测定内源植物激素【Ｊ】．植物生理学通讯，１９８８，（５）：５３—５７． 杨秋生，籍越．保鲜液对郁金香切花寿命和内源激素含量的影响（简报）［Ｊ］．植物生理学通讯，１９９６，（６）：４１６—４１９ 高俊平，张晓红．月季切花开花和衰老进程中乙烯变化类型初探ＩＪ１．园艺学报，１９９７，２４（３）：２７４—２７８． 蔡蕾，高俊平，等．乙烯对不同切花月季品种开花和衰老的影响［Ｊ］．园艺学报，２００２。２９（５）：４６７—４７２． 丁静，植物内源激素的提取分离和生物鉴定【ＪＪ．植物生理学通讯。１９７９，（２）：２７． 陈雪梅，王沙生．ＨＰＬＣ法定量分析植物组织中的ＡＢＡ，ＩＡＡ和ＮＡＡ［Ｊ］．植物生理学通讯，１９９２，２８（５）：３６８—３７１． 金幼菊．气相色谱一质谱联用技术在植物激素分析中的应用【Ｊ］．植物生理学通讯，１９９２，２８（１）：７２—７７． 周燮，徐义俊，陈婉芬．脱落酸（ＡＢＡ）的放射免疫测定法（ＲＩＡ）Ｏ］．南京农业大学学报，１９８５，（１）：８９． Ｗｅｉｌｅｒ ＥＷ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ［Ｊ］．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ，１９８４，（３５）：８５－９５． 罗正荣．植物激素测定方法『Ｊ１．果树科学，１９９０，７（３）：１８６—１９０． Ｔｈｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｉｎ Ｃｕｔ Ｒｏｓｅ ＢＩ Ｈｕｉ—ｔａｏ ，ＺＨＥＮＧ Ｇｅｎ—ｂａｏ ，ＦＥＮＧ Ｊｉａｎ—ｃａｎ’，ＺＨＯＮＧ Ｘｉａｎ ，ＨＵ Ｃｈｕｎ．ｒｕｉ ，ＬＩ Ｚｈｏｎｇ—ｘｉ （１．Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｈｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２．Ｃｈｉｎａ； ２．Ｈｅｎａｎ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｎ ４５００００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｓｔｅｐ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎｓｉｄｅ ｃｕｔ ｒｏｓｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ｔｈｅ ｗａｙ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎｓｉｄｅ ｃｕｔ ｒｏｓｅ ｂａｓｅｄ Ｏｎ ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ｂｕｉｌｔ ｕｐ． ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｕｔ ｒｏｓｅ；ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｏｒｍｏｎｅ；Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙｓ；ＥＬＩＳＡ
