农业大学 机械交通学院课程论文
课程名称：传感器原理及工程应用
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DNA生物传感器工作原理及实际应用
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摘要………………………………………………………………………………………………1 关健词……………………………………………………………………………………………1 前言…………………………………………………………………………………………2 1 生物传感器的研究背景……………………………………………………………………2 2 核酸生物传感器………………………………………………………………………………2 2.1核酸杂交生物传感器的原理……………………………………………………………2 2.2DNA杂交生物传感器用于环境样品的微生物检测………………………………………3 2.3肽核酸传感器……………………………………………………………………………4 3 污染物的检测…………………………………………………………………………………6 3.1 DNA传感器检测芳香族化合物…………………………………………………………6 3.2 DNA传感器制备核酸修饰滴汞电极……………………………………………………6 3.3 DNA传感器检测环境中的有毒物质……………………………………………………6 3.4 DNA传感器用于检测肼类化合物………………………………………………………7 3.5 DNA内在响应的变化用于检测DNA的物理损伤…………………………………………7 3.6 DNA传感器的其它用途…………………………………………………………………7 4.结论……………………………………………………………………………………………7 参考文献…………………………………………………………………………………………8
DNA生物传感器工作原理及实际应用
张喜龙
摘要：基于生物催化和免疫原理的生物传感器在环境领域中获得了广泛应用。 近年来，随着分子生物学和生物技术的发展，人们开发了以核酸探针为识别元件, 基于核酸相互作用原理的DNA生物传感器。该传感器可用于受感染微生物的核酸序列分析、优先控制污染物的检测以及污染物与DNA之间相互作用的研究， 在环境污染监测中具有潜在的巨大应用前景。 简要介绍了核酸杂交生物传感器的基本原理及其在环境微生物和优先控制污染物（priority pollutant）检测中的应用研究进展。
关键词：DNA ；生物传感器；核酸杂交；环境监测；优先污染物
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前言
生物传感器对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。是由固定化的
生物敏感材料作识别元件（包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质）与适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等等）及信号放大装置构成的分析工具或系统。本文介绍的DNA生物传感器是当前发展最迅速的基因检测方法之一，其应用范围广泛，包括传染病快速检验、疾病基因诊断、环境监测、食品安全、法医鉴定等。用于DNA生物传感器的检测技术包括荧光技术，石英晶体微天平，电化学发光，表面等离子共振光谱和电化学方法,DNA探针等 , 本文主要介绍了,DNA传感器的工作原理, DNA生物传感器对环境检测的应用，及其他医疗卫生方面的应用。
1 生物传感器的研究背景
生物传感器在环境监测中起着越来越重要的作用。固定化生物层与目标污染物之间的
专一性作用是设计生物传感器的理论基础，基于生物催化（酶、微生物等）和免疫原理的生物传感器已在环境领域中获得了广泛应用。 然而利用核酸探针为敏感元件的传感器在环境监测中开发应用尚处于起步阶段。分子生物学与生物技术的进展为研究DNA生物传感器提供了可能。与酶和抗体不同，核酸识别层十分稳定，并且易于合成或再生以供重复使用。DNA环境生物传感器在环境分析领域将起着十分重要的作用。
DNA传感器除可用于受感染微生物的核酸序列分析，微量污染物的监测外，还可用于研究污染物与DNA之间的相互作用，为解释污染物毒性作用（包括致畸，致癌，致突变作用）机理提供了可能。
2 核酸杂交生物传感器
DNA序列分析为检测环境微生物和病原菌提供了基础。传统的DNA序列分析基于电泳分离与放射性同位素（32P）检测相结合，该法费时费力，不适用于日常和快速的环境分析，尤其是现场检测。新近开发的用于DNA序列分析的杂交生物传感器可以大大地减少分析时间简化分析手续，可用于快速现场监测，如自来水厂突发性污染事故的分析等。
2.1 核酸杂交生物传感器的原理
核酸杂交生物传感器的理论基础是DNA碱基配对原理。高度专一性的DNA杂交反应与高灵敏度的电化学检测器相结合形成的DNA杂交生物传感器，在环境生物技术领域中将大有所为。 在DNA杂交生物传感器检测过程中，形成的杂交体通常置于电化学活性指示剂（如氧化2还原活性阳离子金属络合物）溶液中，指示剂可强烈地，但可逆地结合到杂交体上（图1）。由于指示剂与形成的杂交体结合，产生的信号可以用电化学法检测。
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图1 电化学DNA生物传感器杂交检测原理示意图
2.2 DNA杂交生物传感器用于环境样品的微生物检测
Wang等开发出了DNA杂交生物传感器并用于环境样品的微生物检测，如水体中病原菌
Cryptosporidium 的测定，Escherichia coli 的测定，这类传感器的研究包括核酸探针固定化的优化、杂交反应条件、指示剂的结合与检测等。杂交过程并不是一个简单的在液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链的反应。影响杂交的因素很多，特别要注意影响杂交反应动力学和效率的因素，包括杂交时间、离子强度、探针长度、序列和杂交温度等，以保证其高度专一性和灵敏度。
合适长度的DNA片段有利于探针与之杂交，DNA分子中任何带正电荷或负电荷残基都会影响杂交效率。此外，在有利于杂交双链形成的条件下，探针分子本身也有利于形成自身双链的二级结构甚至三级结构，使靶序列不易被检测到，解决杂交中诸多问题的一个重要办法是用PNA代替DNA作为探针。
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2.3 肽核酸传感器
Nielson等研究了以肽核酸（peptide nucleicacids ,PNA）作为探针的另一类传感器。
肽核酸是以肽为骨架的一种新型的DNA模拟物，具有与DNA和RNA结合的高度亲和性，良好的稳定性，并能方便地固相合成。PNA的化学结构如（图2）所示。
其骨架由重复的N2（22氨乙基）2甘氨酸通过酰胺键相连而成。在PNA中，中性的准肽链（pseudopeptide chain）代替了DNA中的戊糖一磷酸骨架（图2)。由于没有带电荷的磷酸基团，杂交时不需要盐离子以抵消DNA链之间的静电排斥，这样DNA与PNA更易靠近而形成杂交分子，并且形成的PNA2DNA杂交分子的稳定性和碱基配对的特异性得到极大提高。PNA2DNA 形成碱基配对的结构式如（图3）所示。
图2 PNA与DNA结构
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图3 PNA与DNA的碱基配对
3 污染物的检测
利用DNA不同识别模式来设计DNA传感器，除常用的DNA碱基配对杂交原理外，还可利用污染物的毒性作用（如致癌、致突变）来设计新的环境生物传感器。
3.1 DNA传感器检测芳香族化合物
Pandey等研究了一种DNA传感器来检测芳香族化合物。他们用固定化的双链DNA分子层作为识别元件，当目标污染物芳香化合物存在时，溴化乙锭指示剂流动注射响应信号的减弱，可用来测定目标污染物。
3.2 DNA传感器制备核酸修饰滴汞电极
Pulecek等将电极浸泡在修饰溶液中，让生物大分子强烈地，且不可逆地吸附在电极表面，以此来制备核酸修饰滴汞电极，并用于研究DNA与药物和蛋白质之间的相互作用。
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3.3 DNA传感器检测环境中的有毒物质
Wang等利用污染物与DNA在核酸修饰碳电极表面的相互作用来检测环境中的有毒物质。他们利用双链DNA（ds DNA）层与芳香胺之间的键合作用，设计了一种新型的亲和电化学生物传感器，并用于检测芳香胺类化合物，检测限达到纳摩尔量级。（图4）显示了利用该传感器分析受污染地下水样品的结果。经过非常短的预浓缩时间（3 min）后，当加入4 ×10 - 7 mol/ L 和8 ×10 - 7 mol/ L 22氨基蒽时，传感器检测出两个氧化峰值。（图4b、c中的Ⅱ）。 未受22氨基蒽污染的天然地下水不产生检测信号峰。峰Ⅰ大约在+ 110 V 处，为DNA鸟嘌呤残基的氧化峰。可以看出，随着芳香胺浓度升高，阴极鸟嘌呤峰逐渐变弱。这是由于芳香胺与dsDNA键合导致鸟嘌呤部分变化引起的。
图4 DNA碳电极生物传感器测定受污染地下水中的22氨基蒽
(a) 未受22氨基蒽污染的地下水；(b) 加入4 ×10 - 7 mol/ L22氨基蒽；(c) 加入8 ×10 - 7 mol/ L 22氨基蒽。
3.4 DNA传感器用于检测肼类化合物
他们还开发了一种高灵敏度的DNA生物传感器用于检测肼类化合物。将dsDNA修饰电极置于该类化合物中，由于N2甲基鸟嘌呤形成，引起鸟嘌呤峰减弱（因为鸟嘌呤的氧化是通过N7 位置进行的)。这种鸟嘌呤响应峰的抑制与肼类物质的浓度相关性很好，从而为检测环境中微量肼类物质污染提供了一种方便快捷的方法。
3.5 DNA内在响应的变化用于检测DNA的物理损伤
DNA内在响应的变化还可用于检测DNA的物理损伤。近年来，开发分析评价DNA辐射损伤
的方法越来越引入注意，Palecek等早期研究工作是利用滴汞电极的极化曲线来分析γ2辐射和紫外辐射对DNA的损伤。该法依赖于辐射剂引起的DNA双螺旋结构的构型和结构的微小改变与DNA电化学响应应用的灵敏度。
Wang等目前正在致力于利用阴极DNA2鸟嘌呤的信号改变来开发微结构传感器芯片，用于检测辐射损伤。该传感器还可用于筛选会引起DNA损伤的化学试剂。
3.6 DNA传感器的其它用途
DNA生物传感器除用于检测外，还可用于研究污染物与DNA之间相互作用，用于解释不同污染物的毒性作用机理。例如，DNA传感器可用于适时研究DNA与化学诱变剂之间反应动力学。 在污染物与DNA结合相对强度方面提供有用信息，解释污染物2DNA键合的专一性，或探讨DNA 结构变化。
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4 讨论
DNA生物传感器的优点：与常规的核酸检测相比，DNA传感器有以下特点：①可以进行
液相杂交检测：常规的核酸检测方法主要是固相杂交，DNA传感器可以直接在液相反应通过声、光、电等信号的变化，对靶物质的DNA进行定量测定；②可以进行DNA实时（real-time）检测：把DNA传感技术和流动注射技术相结合，对DNA的动力学反应过程可以随时进行监测，并可以对DNA进行定量、定时测定，实现了DNA的在线和实时检测；③可以对活体内核酸动态进行检测：目前尚缺乏有效的方法对活体内核酸直接进行研究，DNA传感技术为对活体内的核酸代谢转移等动态过程研究提供了可能；④可以进行DNA的大量智能化检测：DNA传感技术和人工神经网络技术相结合，可以筛选出选择性和活性更高的敏感元件，研制成多功能、智能化的DNA传感器，可以对多种DNA样品同时检测；⑤灵敏度高：DNA传感器可以对靶物质直接检测，可以结合PCR技术和光学技术及DNA嵌合剂的介入，提高检测的灵敏度，实现对低拷贝核酸的检测；⑥特异性强：DNA传感器是根据DNA碱基的互补结合原理制作的，因此，DNA传感器特异性非常强；⑦无污染：DNA传感器不需要同位素标记，避免了有害物质的污染。
DNA生物传感器的缺点：①响应时间方面：目前在DNA传感器的研究中，虽然较好地解决了可逆性和特异性识别的问题，但在传感器的响应时间和灵敏度方面却不尽如人意,在已报道的各种DNA传感器中，响应时间大部分在几十分钟到1小时以上。这相对于典型的过夜杂交(20 h)来说无疑是一个巨大进步，但对于传感器来说是太长了。这不仅使其动态监测的优势大打折扣，而且是大批量样品测定的致命弱点；②灵敏度方面：目前DNA传感器的研究还处于初级阶段，虽然在某些方面有所突破，但在灵敏度方面与现行的PCR等方法还有差距。
5 结论
DNA生物传感器应用于环境污染监测有着广阔的前景。目前，核酸识别分子层的研究与利用还处于初期阶段。DNA生物传感器为生物传感器家族中添加了新的成员，DNA传感器的实现需要正确地选择核酸探针及其固定化和DNA识别信号的有效转换与检测。毫无疑问，随着该项技术的不断深入研究和日臻成熟，DNA 生物传感器将成为环境污染监测领域中的一个重要手段。
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参考文献:
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