荧光定量PCR仪操作规程
1．开机程序
（1） 打开电脑，进入桌面。
（2）打开PCR仪器的电源开关（注：该仪器有两个电源开关，一个控制PCR仪，一个控制光源系统）。
（3）双击桌面上的软件图标，点击“yes”,进入软件的主菜单。
(4)或打开开关，视窗上显示“SELF TEST”，显示10秒中后，显示RUN-ENTER菜单：“RUN ENTER PROGRAM ”准备执行程序。
2．关机程序
(1) 保存数据，退出软件的主菜单。
(2) 关掉电脑，关闭PCR仪器的电源开关。
3.程序文件的设置及打开
(1)实验程序已预先设定
点击软件左方主目录中的“Library”，进入该界面后。选择“View Protocol(查看协议)”页面，根据路径，找到预存的程序文件。
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放入样本管，关紧盖子。运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》，用箭头键选择已储存的程序，按《Proceed》，则屏幕显示：“-ENABLE DISABLE HEATED LID” 按《Proceed》选择ENABLE，则开始执行程序。
(2)创建新的程序文件
点击软件左方主目录中的“Workshop”，进入该界面。选择“Edit Protocol”页面，输入相应的温度、时间、重复的循环数（Repeats），增加或删除步骤（Cycle和Step），在“Select data collection step（s）”中选择需要进行荧光收集的步骤。完成后，在“Protocol Filename”中输入程序的文件名，点击“Save this protocol”。
如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM，按《Proceed》，屏幕显示“ -NEW LIST EDIT DELET”，按《Proceed》，1）选择NEW，命名新的程序，最多8个字母，输入后按《Proceed》确认。输入程序步骤：名字输入后，显示“ STEP1 TEMP GOTO OPITON END”，按《Proceed》则可以输入温度（0～100℃），按《Proceed》确认后，则可以输入孵育时间，用《Select》键移动光标，输入数字，完成后按《Proceed》确认，跳到下一步，输入方式同上。选择GOTO，输入循环步骤时链接到第几步（循环数最多可达9999次）（为实际循环数-1)。选择option，显示“STEP EXTENDI NCREMENT SLOPE ”再选择increment，按《Proceed》确认，输入初始的温度，确认后输入时间，按《Proceed》确认，然后输入每个循环增加或减少的温度，增加用正值，减少用负值（-0.1℃～6℃），按《Proceed》确认。选择extend，按《Proceed》确认，输入每个循环增加或减少的时间（-60～60秒），按《Proceed》确认。
选择slop（指温度上升或下降的速率），输入温度的改变值（-0.1～1.5℃）按《Proceed》确认，然后输入加热或致冷的速度，按《Proceed》确认。选择End，输入结束步骤。
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输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行。
4.仪器操作程序
(1)编辑样本
将装有反应液的PCR反应管放入PCR仪，记录样本摆放顺序。点击进入软件左方主目录的“Workshop”界面，选择“Edit Plate Setup”页面。点击“Samples：Whole Plate loading”，根据样本摆放的顺序和样本属性，选择相应的图标（Unknown和Standard），在plate上相应位置作标识，是标准品（Standard）的，在屏幕右下方的“Standard Quantity”中输入相应浓度。点击“Select and load fluorophores”，在“1. or deselect a fluorophore”中选择荧光标记，在“2.Assign a color”中选择该标记相对应的颜色，然后在plate上对 1.3所选择的孔位进行荧光标记。完成后，在“Plate Setup Filename：”中输入样本文件的文件名，点击“Save this plate setup”。
(2)运行
编辑样本完成后，在该页面下点击“Run with selected protocol”。转入“Run Prep”页面，确认“Select run purpose”所选的是“PCR Quantification Melt Curve”和“Select well factor source”所选的是“Experimental Plate”，核对一下“Selected Protocol”和“Selected Plate”的文件名是否正确。然后在“Sample volume”中输入反应体系，点击“Begin Run”，在弹出的对话框中输入要保存的数据文件名称，点击保存。
5.数据分析
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点击软件左方主目录中的“Library”，进入“View Post-Run Data”页面,
找到并选中要分析的数据文件，点击“Analyze Data”，转入“Data Analysis”界面。根据“baseline”和“Threshold”分析原则，进行数据分析，观察PCR Standard Curve”。
6、其它：用《pause》可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。用《stop》或《Cancel》可停止运行的程序。
**可以用《Cancel》键删除输错的值，输入新的值后按《Proceed》确认。**对于未输完的程序，要先输入END，按《Proceed》将程序储存后才能删
除。
**删除已经储存的程序：从RUN-ENTER菜单中选择RUN－PROGRAM
《Proceed》，显示主菜单，选择DELET，用《Select》选择删除。查看程序的步骤：在主菜单上选择LIST，按《Proceed》，用《Select》将选择名称，再按《Proceed》，显示程序的第一步，用《Select》键向前、向后翻页查看，此时不能改变程序的值。编辑已有的程序：
如何设置一个PCR体系：一般分为8步：
预变性：可用94～95℃，2～10min，一般用5min。
变性：一般用94℃，30s～2min，一般45s～1min。
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退火：温度自定，30s～2min。
延伸：70～75℃，一般72℃，对于＜2kb，＜1min；＞2kb，每增加1kb加1min。
循环数：一般25～35个循环。
最终延伸：72℃，5～15min。
保存：10℃，时间设为0。
Abs Quant：绝对定量或定性分析；Rel Quant：相对定量；Scanning：基因扫描； Color Comp：颜色补偿；Tm：熔解温度检测；Melt Geno：熔解曲线法基因分型； Endpt Geno：终点法基因分型
在界面右方编辑各样本的名称属性等： Pos：样本在96孔板或384孔板上的座标位置；Repl Of：重复样本设置； Sample Name：样本名称；Quantification Sample Type：定量样本类型；Concentration：浓度；Target Name：检测类型
在进行绝对定量检测实验时，参与实验的样本有标准品（一般4至5个）、阴性对照、阳性对照、未知样本。各样本的名称可参考以上“Sample Name”中的命名习惯（STD表示标准品、NC表示阴性对照、Positive表示阳性对照、Sample表示待检测的未知样本），也可以自行编辑。
在“Quantification Sample Type”一栏内需要对各样本的类型进行明确地编辑（标准品选Standard类型、阴性对照选Negative Control类型、阳性对照选Positive Control类型、未知样本选Unknown类型），此外标准品系已知浓度的阳性样本，其设定为
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Standard类型后还需在Concentration一栏中对各标准品分别设定其相应的浓度，以及在Abs Quant/Units填写框中填写相应的浓度单位，如copies、pg等。 在Target Name一栏中可以填写该检测实验所要检测的指标，如乙肝病毒、禽流感病毒、沙门氏菌等。
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