植物缺素培养及其还原酶活力和根系活力测定
实验名称 实验目的 植物缺素培养及其还原酶活性和根系活力测定 掌握植物溶液培养的基本方法，并通过植物的缺素培养，观察并认识N、P和K等矿质元素的转移缺素症状及各元素的生理功能。还原酶（EC.1.6.6.1，缩写NR）是盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可以初步掌握测定还原酶活性的原理和方法以及测定根系活力的方法。 实验方案 【试验原理】 矿质元素是维持植物生长的重要的营养物质。植物在含有全部营养物质的完全按培养液中，可以正常发育。若植物在缺素培养液中，则会出现单一的缺素症，从而可以确定植物在生长发育中的生理功能。 还原酶活性一般采用活体法或离体法测定。离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为还原酶粗酶液进行测定。由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO 进入细胞后，被还原酶还原成NO 并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO 的含量即可得知还原酶活性的大小。活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，应作一定量的重复。本实验采用活体法测定还原酶活性。 氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲臢（TTF），TPF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。 【器材和试剂】 1、植物材料：已经发芽的小麦种子 2、实验器材：烧杯、移液管、量筒、培养容器、通气设备、pH试纸、天平、镊子、培养皿、毛笔、分光光度计、天平、打孔器、试管、研钵 3、实验试剂：0.1mol/L HCl、0.1mol/LNaOH 用分析纯级药品和无离子水，配制大量元素和微量元素贮备液 元素贮备液的配制 大量元素贮备液 药品名称 Ca(NO3)2 KH2PO4 MgSO4.7H2O KCl NaH2PO4 NaCl CaCl2
微量元素贮备液 药品名称 H3BO3 ZnCl2 CuSO4.5H2O H2MoO4 MnCl2 1
质量浓度/(g.L-1) 100 25 25 12 25 9 103 质量浓度/(g.L-1) 2.86 0.22 0.08 0.02 0.08 植物缺素培养及其还原酶活力和根系活力测定
Fe-EDTA 2680mgEDTA于1L蒸馏水中加热，趁热加入2gFeSO4.7H2O,并强捏搅拌 培养液的配制 贮备液 完全液 Ca(NO3)2 KH2PO4 MgSO4.7H2O KCl NaH2PO4 NaCl CaCl2 Fe-EDTA 微量元素 蒸馏水 10 10 10 10 - - - 2 1 957 1000ml不同培养液及其配制所需贮备液体积/ml 缺N液 - 10 10 10 - - 10 2 1 957 缺P液 10 - 10 20 - - - 2 1 957 缺K液 10 - 10 - 10 10 - 2 1 957 缺Fe液 10 10 10 10 - - - - 1 959 【实验步骤】 ① 配制培养液，分别是完全液、缺N液、缺P液、缺K液、缺Fe液。配制的成分见营养液配制表 ② 选取20个培养器皿，每4个为一组，分5组，分别为完全液、缺N液、缺P液、缺K液、缺Fe液，并贴上标签 ③ 选取生长良好、大小一致的小麦幼苗，用毛笔去除根上的纸屑，小心的把根插入培养瓶的盖孔中，用棉花将幼茎裹住固定，注意将根浸入培养液中，每瓶可以移栽8株，将20个培养皿放满。留下一孔为通气用，不通气时用棉花塞住 ④ 培养期内每隔1～3天通气一次，以保证根系的氧气供应，每隔3天补充无离子水，以补充水分的丢失，每两周换一次培养液，植株长大些时每一周换一次培养液， ⑤ 记录培养初期幼苗的生长发育状况（株高，根长，茎的粗细和颜色，叶片的数目、大小和颜色等），注意缺素培养所表现出的症状和最先出现症状的部位，记录 ⑥ 分析试验结果，说明缺素症出现的时间与部位和相应的症状 ⑦ 取小麦叶片洗净，打孔称量0.5g两份，一份加入5mlPBS+5mlKNO3,另一份加5mlPBS+5ml蒸馏水，真空渗入，置于50ml三角烧瓶中，30摄氏度恒温箱保温30min. ⑧ 各反应液取1ml,分别加入2ml磺胺和2ml a-萘胺摇匀，在恒温水浴保温20min. ⑨ 在分光光度计520nm,波长测定吸光值，对照曲线，计算酶活度。 ⑩ 取小麦根系，去除胚乳，洗净擦干，取0.2g两份，分别投入5mlTTC+5mlPBS溶液。另一份放入2mlH2SO4+5mlTTC+5mlPBS溶液，注意根系完全浸没，置于37摄氏度恒温箱避光保存 ⑪ 1～2小时后取出烧杯，在第一份中加入H2SO4终止反应，观察根尖着色情况 ⑫ 用镊子去除根尖，吸干后放入研钵中，3～5ml乙酸乙酯充分研磨，过滤滤液到10ml容量瓶中，多次洗涤残渣，使TTF彻底转移 ⑬ 对照曲线，计算活力 【注意事项】 1、药品均用分析纯级药品，实验器具必须非常干净，各贮备液的移液器要专用，实验药品
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的配制要用无离子水以确保缺素培养的准确性 2、移植植物是要小心，切勿伤根 3、还原酶测定时，植物材料应该在光下预培养 实验结果 氮~缺乏:植株矮小,全株叶色淡绿,老叶枯黄 磷~缺乏:植株生长受阻,叶的宽度变窄,叶片较小叶色暗绿无光泽，部分作物在老叶及茎呈现 紫色 钾~缺乏:生长受阻,老叶的叶缘先端黄化,叶缘叶肉呈现焦枯褐斑，植株软弱,缺水时易萎凋新 叶变暗绿色,伸长抑制变小叶 铁~缺乏:老叶正常,新叶黄化，初期叶脉保持绿色而叶肉黄化使叶脉呈绿色网状，严重时新 页变白变小 完全液：植株生长茂盛，叶片鲜绿 缺氮 缺磷 缺钾 缺铁 完全液 还原酶活力测定 OD=0.153 计算出的酶活力5.737ug/ml 根系活力测定OD=0.172 计算出的酶活力0.256ug/ml
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实验收获 通过本次实验，锻炼了我们的动手能力，也锻炼了我们的思考问题的能力，让我 们对植物的生长有了更多的认识，同时，加深了我们对课本知识的理解，让我们对课本上的原理能够通过自己的实验活动来进一步加深。 小组成员：组长 组员 教师意见 1、 各项目可根据需要扩大大小
2、 以电子稿形式提交，统一用宋体五号字
3、 课程小论文2000字左右，用宋体五号字，英文摘要不做要求 4、 确定交流时间后再通知大家
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