单纯疱疹病毒性角膜炎治疗中应用定量PCR技术的研究
吴年浪;赵江浩;张惠成
【摘 要】目的 在单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)的治疗过程中,研究应用定量PCR检测单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ型DNA数量,结合临床症状体征,指导HSK的治疗.方法 将HSK分成浅层的上皮型角膜炎组和深层的角膜基质炎和角膜内皮炎组,两组再按不同治疗方法各分A、B两组,A组为单纯局部用药,B组为A组基础上联合口服阿昔洛韦.以症状体征评分的变化来比较单纯局部用药与联合口服阿昔洛韦的不同治疗效果.所有患者在治疗前与治疗后作定量PCR检测HSV-Ⅰ DNA数量,以定量PCR数值的lg数作为定量PCR得分来比较AB组的PCR数值变化,与症状体征评分对照来指导HSK的治疗.结果 所有HSK病人治疗后8周A组症状体征评分均显著大于B组,差异有统计学意义.上皮型角膜炎病人的定量PCR得分显示治疗后A＞B,差异有统计学意义.深层型角膜炎病人治疗前后定量PCR无显著差异.上皮型角膜炎中定量PCR值＞10 5的病人,治疗后6、8周,A组症状体征评分显著＞B组,差异有统计学意义；＜ 105的病人,A、B两组症状体征评分无显著差异.结论 对于上皮型角膜炎,定量PCR有以下的作用:①可定性,用于明确单纯疱疹病毒Ⅰ型感染；②可定量,明确HSV-Ⅰ型DNA拷贝数,如拷贝数＞ 105,建议加用口服抗病毒药；如拷贝数＜ 105,可以单纯局部抗病毒.对于角膜基质炎和角膜内皮炎,定量PCR意义不大. 【期刊名称】《医学研究杂志》 【年(卷),期】2013(042)006 【总页数】4页(P133-136)
【关键词】单纯疱疹病毒;角膜炎;PCR;阿昔洛韦
【作 者】吴年浪;赵江浩;张惠成
【作者单位】310006 杭州市第一人民医院眼科;310006 杭州市第一人民医院眼科;310006 杭州市第一人民医院眼科 【正文语种】中 文
病毒性角膜炎是当今世界上危害严重的感染性眼病之一，发生率占角膜病的首位，近年由于抗生素和皮质类固醇的广泛应用，其发生率有明显上升趋势，而且由于反复发作可引起视功能损害，是一种全球性的重要致盲眼病［1］。目前临床治疗过程主要是通过观察眼部体征的变化而进行，如何治疗主要靠医生的经验，缺乏一个客观的指导治疗的方法。病毒性角膜炎主要由HSV－Ⅰ感染引起，定量PCR是目前检测HSV－Ⅰ的最敏感方法［2］。笔者医院于2010年6月2012年6月对27例HSK治疗过程中应用定量PCR技术检测HSV－Ⅰ，并结合临床症状体征进行分析，取得了较好的结果，现报道如下。 资料与方法
1．分组:采用前瞻性、随机、分层、对照的研究方法。选择2010年6月2012年11月笔者医院就诊的HSK病例，参照《中华眼科学》［3］ 与 Holland 等［4］ 提出的 HSK 的 4 项分 类 标准［3，4］，因为浅层和深层角膜炎的症状体征及治疗均有较大差别，故按角膜炎发病部位再分浅层和深层2个大组，选取上皮型角膜炎病人为浅层组，选取角膜基质型炎和角膜内皮炎病人为深层组。2个大组再采用随机数字表法分成A、B两组。浅层组中A组为对照组，使用0．15%更昔洛韦凝胶，每日4次，每次1滴，滴入结膜囊内;B组为实验组，在A组基础上联合阿昔洛韦胶囊每日3次，每次500mg，用药时间为8周;深层组A、B两组治疗方案与浅层组类同，只是每个病人都添加了0．1%氟美瞳滴眼液每日3次滴眼。
患者入选条件:未用药的患者、全身未应用或停用抗病毒药物至少l周、受试期间眼部和全身禁用其他抗病毒药物、不伴有其他眼病、肾功能正常者。排除条件:妊娠及哺乳期妇女、严重心肺肝肾功能异常者、糖尿病与恶性肿瘤病史者、双眼发病者。共诊治HSK 27例，男性16例，女性11例，右眼14例，左眼13例，年龄2366岁，平均年龄47．15±11．42岁。其中浅层组16例，包括树枝状角膜炎13例、地图状角膜炎3例。随机数字表法分组结果为A组8例，B组8例;深层组11例，其中角膜基质炎5例、角膜内皮炎6例，随机数字表法分组结果为A组5例，B组6例。
2．临床观察与评价项目:分别于治疗前和治疗后1、2、4、6及8周随访，检查视力(国际标准视力表)，用裂隙灯显微镜进行详细的眼前节检查，并对症状体征等项目进行评价记分与统计学处理，症状体征均按严重程度记04分。其中，症状包括:视物模糊、畏光、异物感、流泪、眼痛等;如视物模糊:无视物模糊为0分;视物模糊不影响日常工作生活为轻度，记1分;对日常工作生活影响较大为中度，记2分;严重影响日常工作生活为重度，记3分;不能维持日常工作生活为极重度，记4分。畏光、异物感、流泪、眼痛等同样按严重程度记04分。体征包括:结膜充血、结膜水肿、睫状充血、角膜炎症反应、角膜后弹力层皱褶、角膜后沉着物、房水闪辉等，按各体征的严重程度记04分。比如角膜后沉着物:无角膜后沉着物为0分;3个或以下为轻度，记1分;410个为中度，记2分;10个以上，但仍可数为重度，记3分;很多，不可数为极重度，记4分。以症状体征评分的改善情况来比较单纯局部用药与联合口服阿昔洛韦的不同疗效。
所有患者在治疗前与治疗后1、2、4、8周取泪液做定量PCR检测HSV－Ⅰ型DNA数量。用自带棉签的无菌试管取材，取材前先加1ml生理盐水至试管内，湿润棉签，再甩干棉签，用棉签在患者角膜表面及结膜表面轻轻擦过，取眼表泪液送定量PCR。PCR取材均在荧光素染色检查之前，以免荧光素造成PCR的干扰。以
定量PCR数值的lg数(以10为底的对数)作为定量PCR得分来比较单纯局部用药与联合口服阿昔洛韦的PCR数值变化，与症状体征评分对照来指导HSK的治疗。 3．统计学方法:采用SPSS 17．0统计软件，因样本数较小，症状体征的评分差异采用小样本均数t检验，PCR得分采用χ2检验，P＜0．05为差异有统计学意义。 结 果
1．症状体征评分变化情况:所有HSK病人治疗后症状体征评分A组均＞B组。小样本均数t检验示治疗后8周，A组的症状体征评分均显著＞B组，差异有统计学意义，具体见表1。
2．PCR变化情况:16例上皮型角膜炎中，治疗前HSV－Ⅰ型DNA阳性12例，阳性率为75%，HSV－Ⅰ型 DNA 数量为 9．11 ×1037．96 ×107，平均5．56×105;11例角膜基质炎和角膜内皮炎中，治疗前HSV－Ⅰ型DNA阳性2例，阳性率为18．2%，HSV－Ⅰ型DNA 数量为2．37×1038．25×104，平均 1.40×104。治疗后4组定量PCR阳性率及HSV－Ⅰ型DNA拷贝数均逐渐下降，具体见表2。上皮型角膜炎病人的定量PCR得分显示治疗后A＞B，差异有统计学意义。具体见表3。深层型角膜炎病人A、B组治疗后定量PCR无显著差异。 表1 4组患者治疗前后症状体征评分表周评分上皮型角膜炎 A 组 8 14．37 ±4．03 9．50 ±5．00 6．00 ±3．57 4．13 ±2．94 3组别 n 治疗前评分 治疗后1周评分 治疗后2周评分 治疗后4周评分 治疗后6周评分 治疗后8．00 ±2．25 1．50 ±1．13上皮型角膜炎 B 组 8 14．13 ±2．16 7．25 ±2．25 3．25 ±1．56 1．75 ±1．25 0．63 ±0．63 0．25 ±0．38 t 0．233 1．425 2．282 1．786 3．109 3．333 P＞0．5 ＞0．1 ＜0．05 ＞0．05 ＜0．01 ＜0．005深层角膜炎 A 组 5 22．40 ±5．52 19．00 ±5．60 14．60 ±5．12 11．80 ±6．96 9．40 ±6．48 6．80 ±5．76深层角膜炎 B 组 6 23．67 ±6．00 16．83 ±7．78 14．00 ±7．00 10．33 ±5．67 6．50 ±3．83 1．50
±1．50 t 0．825 0．808 0．251 1．2 1．478 2．393 P ＞0．2 ＞0．2 ＞0．5 ＞0．2 ＞0．1 ＜0．05
表2 PCR阳性例数及平均HSV－ⅠDNA拷贝数表组别 治疗前 治疗后1周 治疗后2周 治疗后4周 治疗后8周上皮型角膜炎A组n 63300上皮型角膜炎B组平均拷贝数 4．766×105 3．758×105 6．918×103 0 0 n 6 2 0 0 0深层角膜炎A组平均拷贝数 6．481×105 6．926×104 0 0 0 n 1 1 0 0 0深层角膜炎B组平均拷贝数 8．250×104 6．730×102 0 0 0 n 1 0 0 0 0平均拷贝数 2．370×1030000
表3 上皮型角膜炎病人两组定量PCR得分比较表组别 治疗前 治疗后1周治疗后2周治疗后4周、8周 χ2P A组B组34．069 34．870 16．725 9．681 11．520 0 00 10．783 ＜0．05
3．定量PCR＞105和＜105上皮型角膜炎病人治疗前后症状体征评分变化情况:研究发现，对于上皮型角膜炎中定量PCR值＞105的患者，治疗上较麻烦，症状体征评分下降缓慢。故特将定量PCR＞105和＜105上皮型角膜炎病人治疗前后症状体征评分变化情况另外列表，小样本均数t检验结果显示:对于上皮型角膜炎中定量PCR值＞105的病人，治疗后6周、8周，A组症状体征评分显著大于B组，差异有统计学意义;对于上皮型角膜炎中定量PCR值＜105的病人，A、B两组症状体征评分无显著差异，具体见表4。
表4 定量PCR＞105和＜105上皮型角膜炎病人治疗前后症状体征评分变化表周评分A 组(PCR ＞105) 4 13．75 ±5．25 9．75 ±5．75 7．75 ±4．75 6．50 ±3．50 5组别 n 治疗前评分 治疗后1周评分 治疗后2周评分 治疗后4周评分 治疗后6周评分 治疗后8．00 ±2．50 2．75 ±1．13 B 组(PCR ＞105) 3 14．67 ±0．44 9．00 ±2．00 4．67 ±1．11 2．33 ±1．11 0．33 ±0．44 0．33 ±0．44 t 0．297 0．157 1．116 2．550 3．191 3．837 P＞0．5 ＞
0．5 ＞0．2 ＞0．05 ＜0．05 ＜0．02 A 组(PCR ＜105) 4 15．00 ±2．50 9．25 ±4．25 4．25 ±2．75 1．75 ±1．25 1．00 ±1．00 0．25 ±0．38 B 组(PCR ＜105) 5 13．80 ±2．96 6．20 ±1．84 2．40 ±1．52 1．40 ±1．28 0．80 ±0． 0．20 ±0．32 t 1．172 1．887 1．9 1．011 0．676 1．778 P ＞0．2 ＞0．1 ＞0．5 ＞0．2 ＞0．5 ＞0．1 讨 论
病毒性角膜炎是当今世界上危害严重的感染性眼病之一，且由于HSV潜伏在三叉神经的感觉神经元内，单纯局部治疗难以根除病毒的复发。国内外已有应用口服阿昔洛韦或中药防治HSK，取得了一定的效果［57］。笔者医院的研究结果也显示口服阿昔洛韦联合局部用药比单纯局部用药疗效更佳。虽然口服抗病毒药联合局部用药疗效更佳，但单纯局部用药也有治疗效果，而且口服抗病毒药增加了患者经济负担，还可能会诱发肝肾功能损害等一系列毒性不良反应。到底该如何治疗HSK，是不是只能凭经验，看起来比较重就用口服抗病毒药，有没有什么完全客观的方法来指导HSK的治疗呢?作者想到用定量检测HSV的方法，来指导HSK的治疗，使病人既能获得必需的治疗，又能减少毒性不良反应。
目前常用的检测HSV方法有聚合酶链反应(PCR)、细胞分离培养法、DNA探针杂交等，其中PCR是一种快速、简便、灵敏、特异性强的方法，对HSK的早期诊断及鉴别诊断具有重要意义［8］。研究显示，泪液取材测量HSV－Ⅰ型DNA也是一个简便、灵敏、可靠的检查方法［9］。故可应用泪液取材作定量PCR来检测HSV－Ⅰ型DNA数量，以此来指导HSK的治疗。
根据笔者医院的研究结果，对上皮型角膜炎，定量PCR阳性率较高为75%，高于有些作者的60%阳性率［10］。根据定量PCR得分表，上皮型角膜炎病人治疗后PCR得分A＞B，卡方检验差异有统计学意义。说明定量PCR对HSK确实敏感，有指导上皮型角膜炎治疗的基础。对于角膜基质炎和角膜内皮炎，定量PCR阳性
率低，对治疗的指导意义不大。
研究发现，对于上皮型角膜炎中定量PCR值＞105的病人，t检验结果显示:治疗后6、8周，B组疗效显著优于A组;对于上皮型角膜炎中定量PCR值＜105的病人，A、B两组疗效无显著差异。所以作者可以认定，不是所有的上皮型角膜炎病人都需要口服抗病毒药，对于定量PCR值＜105的病人可以仅局部抗病毒，因为A、B两组疗效无显著差异。对于定量PCR值＞105的病人需加用口服抗病毒药，因为B组疗效确实优于A组。这样，依据定量PCR就可为病人是否需口服抗病毒药作了一个重要的提示，解决了临床上的一个难题，不光为病人降低了医疗成本，也避免了全身毒性不良反应的产生。
然而是不是一定以105为界呢?笔者尝试以104为界，上皮型角膜炎中，＞104A组6例，治疗后8周症状体征评分为1．833±1．222;＞104B组4例，治疗后8周症状体征评分为0．5±0．5;小样本均数t检验示 t=2．253，t0．05，
8=2．306，P ＞0．05。 ＜104 两组 t检验示 t=2．309，t0．05，4=2．776，P ＞0．05。笔者再尝试以106为界，上皮型角膜炎中，＞106A组2例，治疗后8周症状体征评分为2±0;＞106B组2例，治疗后8周症状体征评分为
0．5±0．5;小样本均数t检验示t=4．243，t0．05，2=4．303，P ＞ 0．05。 ＜ 106 两组 t=2.016，t0．05，10=2．228，P ＞ 0．05。所以，笔者认为 105正是一个分界点，104、106都不是分界点。然而，总的样本数太少，105只是作者发现的一个分界点，是否正好是105为界，有没有更细致量化的分界点，更科学、更严谨的结果需要更大量的样本。
由此得出结论:(1)对于上皮型角膜炎，定量PCR有以下的作用:①可定性，用于明确HSV－Ⅰ型感染;②可定量，明确HSV－Ⅰ型DNA拷贝数，如拷贝数＞105，建议加用口服抗病毒药;如拷贝数＜105，可以单纯局部抗病毒。(2)对于角膜基质炎和角膜内皮炎，定量PCR意义不大。
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