实验六、基因克隆及序列分析
1•目的片段回收
取5卩I PC产物在1.2%琼脂糖凝胶上检测，如果扩增产物大小与原来一致， 在紫外灯管下用刀片切下目标带，然后用 UNIQ-10 Column DNA Collection Kit 试剂盒（上海生工）进行回收。具体回收过程如下：从琼脂糖凝胶中精确切下包 含有目标片段的胶块，放入到 1.5 ml离心管中，加入500止Binding Buffer II , 50C ~60C水浴锅中放置10 min，使胶彻底熔化，然后将熔化的胶溶液转移到套 放于2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min，8000 r/min离心1 min，倒 去收集管中的废液，在 UNIQ-10柱中加入500 pl Washing Solution，室温8000 r/min离心1 min，加入新鲜的 Washing Solution重复一次，倒去收集管中的废液， 室温12000 r/min离心15 s。在UNIQ-10柱中加入Elution Buffer 30 l （直接滴到 过滤膜上），37C放置2 min，放到一个新的1.5 ml离心管后离心收集（12000 r/min，1 min），所得溶液用于连接反应。
2片段连接反应
一_
?
采用pGEM? -T Easy Vector试剂盒（Promega, A1360）进行目标片段的克隆。 取 1.5 lpPCR 产物，加入 0.5 1订4 DNA ligase，0.5 订 Easy Vector, 2.5 legation buffer，短暂离心收集，轻轻混匀，置于室温连接 1-2 h后，放于4C冰箱过夜。
3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
取保存于-70T的大肠杆菌菌株DH5〉菌液，首先在LB固体培养基上分离 单克隆，然后挑一个单克隆进行液体培养过夜。从中取
1.0 ml菌液转接于装有
100 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，于摇床培养1.5~2 h（37°C,240 r/min）， 后转移至预冷的50 ml离心管中，冰浴10 min，低温离心10 min（4C, 4000 r/min） 收集菌体，加入25 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬培养物，冰浴20-30 min，4C 4000r/min离心10 min，去上清液，倒立晾干，再加 2 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2 （含15%的甘油）重悬细胞，分装于冰浴的 0.5 ml无菌离心管中，放入-70C冰 箱保存。
取2 pl连接反应物转到1.5 ml离心管中，冰上保存待用。从-70C冰箱中取 出感受态细胞置于冰上，待其刚好融化时（约 5 min ）小心吸取30-50 k转入到 离心管中，冰上静置20 min。42C水浴中热激90 s （不要摇动）。迅速放回冰上
2 min，然后加入LB培养基（室温）400止，37 C摇床培养1.5 h （150 r/min ）。 从
中取转化培养液100 d平铺于LB平板（含氨苄青霉素、IPTG和X-Gal）上， 正置平板至液体全部被吸收，然后倒置平板于37C培养16~20 h使蓝、白斑充分 呈现。
4重组子筛选、鉴定
对于目标克隆片段，挑选白色单克隆菌落进行液体培养 6 h。取2 d作模板， 用通用测序引物（M13）进行PCR检测，反应体系为（20止）：1沪CR缓冲液， 0.2 mmol/L dNTPs, 1.5 mmol/L MgCb，1.0 U Taq 酶（MBI FermentaS，弓I物 M13，再加20 d矿物油覆盖。PCR循环参数为：94C变性2 min; 94C变性10 s，58C退火45 s，72C延伸60 s，33个循环；10C保存。产物于1.2%琼脂糖 胶电泳检测，若扩增片段大于原来目的片段 200 bp左右，则说明为阳性单克隆。
5克隆片段的测序及结果分析
DNA测序结果分析比对（实例》
2013-00-2211:59 采源：直联网 点击我數：翎化
关龍词：d帕测序结
果
从测序公司得到加一份DMA测序结果通常包含.证口恪式朗测序结果序列文本和俎朗恪式的测序图两亍文件，下面 是一份测序结呆的实例：
CYP3M-E1 1 1（E1B）.ab1 CYP3M-E1-1-1（E1B）.ssq
.汨q文件可以用系统自带的记事本程夢打开，就1文件需要用专门的软件打开.软件茗桃 Chromas 軼件 ChromasTSi
.8 m叹f牛打开后■如下图：
r CYP3A4 \"1 f (EID) (20680531 BF05-. . , - || 口 X 文井⑴awa②粘式映)查着⑩帮朗op
CITCTGGATAGAGAGAGGAGCCirGGACAGrTACTiCACAGRiTAGAG CAGCACCAC&CTCACACCCACCAGAACCCAGCTTTI
CCATGGCCAAGTTTGGGATGAGiflGCCATCACTACTTrCCTTCCTT ATCTCTCTCCTCrGACT£TTTCTTTCAGCTCTCTGa
TTCCTCTTTGCTGQSerameSfrt&CAGCTTTCCTGCCCTGCAC AGCAGTCATTCAGTCAGGCTGTTGGATTGTTTATAB
TGCrGgAgnHGQAGCCFiaGGCTGGAGClGCAGCCAGrAGCA^GGC CCCCTGGGCCabl文件打开后如下图:通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不同的碱基序列•测序图的两端（下图原图的 后半段披剪切特了）大约5卅碱基怖测序图部分通常杂质的干扰校大，无法判读，这杲正常现象.这也提醒我们 在做引物设计时，荽遊免将 所研究的位点XPCFW列的两塔木近（通常建大于50个韓基距离）•以免汎序后难 以分析比对.
我的谟题是研究基因多态性的，因此下而要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因窠变位点为主. 实际上，要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情.一般认为等位基因位 点假如在测序图上出现像套去的两个峰，就是朶合子位点°实际比对后才知道，情况并非那么简单，下而测序图 屮标出的两个輕均不是杂合子位点,如图开说明如下：
100 110 120
说明:
第一组輕，两峰的轴线并不在同一位筐，左侧的T峰是干扰峰;第二组］
,虽两峰轴线位苴相同，但
两峰的位置太靠近了，不是朶合子峰，蓝色的C峰是壬避.通常的朶合子峰由一高一路低的两个轴线相同的峰 组成，比处的序列被机器误判为实际的序列应为W,通常一个高大礙基峰的甬面卜2个位点很容易产生一 个相同破基的干扰峰，峰的高度大约是高大礙基峰的12,离徉越近受干忧越大。
一个摸索出来的规律是：主峰通常在干扰峰的右例，干扰峰并不一定比主峰低.最关键的一点是一定要皇 疑似为臬合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的I:闵结果相比较；一个位点的多个样本相比 校；你得出的该位点朋突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较.
