第４４卷 第１期 Ｖｏ１．４４ Ｎｏ．１ 淡水渔业 ２０１４年１月 Ｊａｎ．２０１４ Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ ｐ３８ＭＡＰＫ在斑马鱼卵母细胞减数恢复中的 作用 丁凤玲 ，魏 华 ，陈阿琴 ，沙晓姣 ，任 周 ，余言想 （１．上海海洋大学水产与生命科学学院，上海２０１３０６； ２．上海农林职业技术学院动物科学技术系，上海２０１６００） 摘要：为了阐明ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶）的激活在斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｄｏ）卵母细胞第一次减数恢复 中的作用，用卵泡刺激素（ＦＳＨ）、ＳＢ２０３５８０（ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂）、ＰＫＡ激活剂ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ单独作用及ＦＳＨ与 ＳＢ２０３５８０、ＦＳＨ与ＰＫＡ抑制剂Ｈ８９共同培养斑马鱼卵母细胞。采集不同培养时间的卵母细胞，用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ 电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ蛋白质免疫印迹技术检测ｐ３８ＭＡＰＫ磷酸化，观察生发泡破裂（ＧＶＢＤ）情况。结果表明，斑马 鱼卵母细胞在ＦＳＨ诱发下，ｐ３８ＭＡＰＫ活性明显升高；单独添加ＳＢ２０３５８０斑马鱼卵母细胞ｐ３８ＭＡＰＫ活性受到明 显抑制，同一时间ＧＶＢＤ发生率均低于对照组以及同时添加ＦＳＨ与ＳＢ２０３５８０的实验组；ＦＳＨ与ＳＢ２０３５８０共同 作用组斑马鱼卵母细胞，ＧＶＢＤ发生率与ＳＢ２０３５８０实验组差异性不显著，与ＦＳＨ组相比显著降低。用Ｈ８９与 ＦＳＨ共同培养卵母细胞时，虽然ｐ３８ＭＡＰＫ仍被激活但量很少。用ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ单独培养卯母细胞，ｐ３８ＭＡＰＫ能被激 活，且比对照组明显升高。结果提示，在ＦＳＨ诱导的斑马鱼卵母细胞减数恢复过程中ｐ３８ＭＡＰＫ被激活，且 ｐ３８ＭＡＰＫ的激活是ＰＫＡ依赖性的。 关键词：斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）；ｐ３８ＭＡＰＫ；卵泡刺激素；ＳＢ２０３５８０；Ｈ８９；ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ 中图分类号：￥９１７．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－６９０７一（２０１４）０ｌ－０００８－０６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ０ｆ ｐ３８ＭＡＰＫ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｉｏｓｉｓ ｉｎ Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ ０ｏｃｙｔｅｓ ＤＩＮＧ Ｆｅｎｇ—ｌｉｎｇ ，ＷＥＩ Ｈｕａ ，ＣＨＥＮ Ａ—ｑｉｎ ，ＳＨＡ Ｘｉａｏ￣ｉａｏ ，ＲＥＮ Ｚｈｏｕ ，ＹＵ Ｙａｈ—ｘｉａｎｇ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１３０６，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１６００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ｐ３８ＭＡＰＫ）ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｍｅｉｏ— ｓｉｓ ｉｎ Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ ｏｏｃｙｔｃｓ，ｔｈｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｕｈｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ：ｎｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＦＳＨ．ＳＢ２０３５８０ （ｐ３８ＭＡＰＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ），ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＰＫＡ ａｃｔｉｖａｔｏｒ），ＦＳＨ＋ＳＢ２０３５８０ ａｎｄ ＦＳＨ＋Ｈ８９（ＰＫＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）．Ｔｈｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｓａｍｐｌｅｄ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅｓ，ｐ３８ ＭＡＰＫ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｗｅｓｔ— ｅｒｎ Ｂｌｏｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｒｍｉｎａｌ ｖｅｓｉｃｌｅ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ（ＧＶＢＤ）ｏｆ ｏｏｃｙｔｅｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐ３８ＭＡＰＫ ａｃｔｉｖ— ｉｔｉｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＦＳＨ．Ｂｕｔ ｐ３８ＭＡＰＫ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｄｒｅｒｉｏ ｏｏｃｙｔｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ．ＳＢ２０３５８０ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ａｎｄ ｔｈｅ ＧＶＢＤ ｒａｔｅ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｃｕｈｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ＦＳＨ ａｎｄ ＳＢ２０３５８０．Ｔｈｅ ＧＶＢＤ ｒａｔｅｓ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｏｏｅｙｔｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ｏｆ ＦＳＨ ａｎｄ ＳＢ２０３５８０ ａｎｄ ｔｈａｔ ｏｆ ｏｏｃｙｔｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｎｌｙ ＳＢ２０３５８０，ｂｕｔ ｔｈｅ ｆｏｒｍｅｒ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ＦＳＨ ｇｒｏｕｐ．ｐ３８ＭＡＰＫ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｏｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｈ８９ ａｎｄ ＦＳＨ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｔｉｌｌ ｈａｐｐｅｎｅｄ．ｗｉｔｈ ｌｉｔｔｌｅ ａ— ｍｏｕｎｔ．Ｔｈｅ ｐ３８ＭＡＰＫ ｃａｎ ｂｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｊｏｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ＦＳＨ，ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｖ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎ－ ｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐ３８ＭＡＰＫ ｗａｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＦＳＨ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｉ０ｓｉｓ ｉｎ Ｄ．ｒｅｒｉｏ ｏｏｃｙｔｅｓ．Ａｎｄ ｐ３８ＭＡＰＫ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｓ ＰＫＡ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ；ｐ３８ＭＡＰＫ；ＦＳＨ；ＳＢ２０３５８０；Ｈ８９：ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ 收稿日期：２０１３—０４—２５；修订日期：２０１３—１２—０５ 资助项目：高等学校博士学科点专项科研基金（２０ｌＯ３１０４１１０００３） 第一作者简介：丁凤玲（１９８６一 ），女，硕士研究生，专业方向为水生生物生理学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｉｎ ｎｇｌｉｎｇ１３１４＠１６３．ｃ。ｍ 通讯作者：魏华。Ｅ．ｍａｉｌ：ｗｅｉｈ＠ｓｈａｆｃ．ｅｄ ｕ．ｃｎ 第１期 丁凤玲等：ｐ３８ＭＡＰＫ在斑马鱼卵母细胞减数恢复中的作用 ９ 丝裂原活化蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏ— 博士德生物工程有限公司）；磷酸酶抑制剂Ｎａ ＶＯ （上海阿拉丁生物有限公司）。 １．１．３培养液 ｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫ）属于丝蛋白一苏氨酸激酶，是 一类接受受体传递的信号并将其带入细胞核内的重 要分子，是参与基因表达、细胞增殖和死亡的 重要机制的组成部分，在多种受体信号传递途径中 均具有关键性作用 ｌ３ Ｊ。ｐ３８ＭＡＰＫ是动物ＭＡＰＫ 对照组培养液（培养液Ａ）：１２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１， ２．４ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣ１，０．２８ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４，０．８ ｍｍｏｌ／ Ｌ ＭｇＣ１２，２２．４ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣ１２，２２ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈｅｐｅｓ， 信号通路中的一条经典途径，由Ｂｒｅｗｓｔｅｒ等于１９９３ 年发现 。最初发现ｐ３８ＭＡＰＫ是细胞内渗透压 反应的调节物，在应激、炎症、细胞凋亡、生长和 ５．６ ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖，１００ Ｕ／ｍＬ青霉素， ０．２ ｒａｇ／ｍＥ链霉素，ｐＨ ７．５。 实验组培养液：在培养液Ａ的基础上根据实 生殖等多种生理活动中有着重要的作用。但是近年 来发现，ｐ３８ＭＡＰＫ在猪和小鼠卵母细胞减数 恢复中也有作用，参与ＦＳＨ诱导的猪和小鼠 卵母细胞减数的恢复 －７Ｉ，从而参与卵母细胞 成熟发育。但ｐ３８ＭＡＰＫ在硬骨鱼类卵母细胞 成熟中的作用还未见报道。因此，ｐ３８ＭＡＰＫ在卵 母细胞成熟中的调节机理是一个非常有研究价值的 新领域。 斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）作为一种模式生物，广泛 应用于胚胎学、发育生物学、毒理学等领域 Ｊ。 但对于斑马鱼卵母细胞的生理学基础研究，特别是 卵母细胞发育生物学研究，还相对比较少见。本实 验通过利用这一模式生物开展ｐ３８ＭＡＰＫ在卵母细 胞减数恢复过程中作用的研究，有助于丰富这 一模式动物在生殖生理学和鱼类生理方面的研究内 容，为正确认识高等动物及人类卵母细胞成熟机制 提供有用信息。 １材料与方法 １．１实验材料 １．１．１实验对象 斑马鱼鱼苗为上海蓝天水族馆的野生品种。按 照光暗比ｌ４ ｈ：１０ ｈ，２８℃水族箱喂养，每周换水 ２次，每天投食２次，直至性成熟后进行实验。 Ｉ．１．２试剂与仪器 Ｋ一４０Ｆ２００倒置解剖镜（ＯＬＹＭＰＵＳ，日本）； 纤维素膜（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ，美国）；１７￣ｘ，２０ｔ３一 ＤＨＰ（Ｓｉｇｍａ，美国）；Ｄ—Ｈａｎｋ’Ｓ溶液（上海迪申 生物技术公司）；ｐ３８ＭＡＰＫ一抗Ｐｈｏｓｐｈｏ—ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，抗兔多克 隆抗体，ＳＢ２０３５８０，ＰＫＡ抑制剂Ｈ８９、ＰＫＡ激动 剂ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ公司，美国）；山羊抗兔 ＩｇＧｈ＋Ｉ Ｉ－ＩＲＰ ｆＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ公司，美国）；预染蛋 白质标准品（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，美国），卵泡刺激素 （ＦＳＨ）（宁波第二激素厂）；ＤＡＢ显色试剂盒（武汉 验要求添加不同药品，ＦＳＨ的浓度分别为１、２、 ５ ＩＵ／ｍＬ；ＳＢ２０３５８０的浓度为１０ ｔｘｍｏｌ／ｍＬ；ＦＳＨ （１ ＩＵ／ｍＬ）和ＳＢ２０３５８０（１０ Ｉｘｍｏｌ／ｍＬ）；Ｈ８９ （４０￣ｘｍｏｌ／ｍＬ）和ＦＳＨ（１ ＩＵ／ｍＬ）；ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ的浓度 为３０ ｉｘｍｏｌ／ｍＬ。 １．２方法 １．２．１卵母细胞收集 用７５％酒精消毒性成熟的雌性斑马鱼体表， 剪开腹部取两侧卵巢置于装有已除菌Ｄ—Ｈａｎｋｇ溶 液的灭菌培养皿中，清洗卵巢３次，去除卵巢周缘 的血液，将清洗后的卵巢移至另一只装有新鲜Ｄ— Ｈａｎｋｇ溶液的培养皿中，小心剥离卵巢中所需的卵 母细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋ溶液洗涤分离好的卵细胞３ 次。 １．２．２卵母细胞的培养 将剥离的卵母细胞分别放人１ ｍＬ含有所需激 素的不同培养液的一次性培养皿中，放置于 ２８．５℃培养箱中培养不同时间。 １．２．３卵母细胞的形态观察 在倒置解剖镜下观察用固定液（乙醇、乙酸、 体积比６：１：３）处理的斑马鱼卵母细胞的 形态。将未观察到细胞核、颜色透亮的卵母细胞计 为发生生发泡破裂（ＧＶＢＤ）的卵母细胞。ＧＶＢＤ率 是指发生ＧＶＢＤ的卵母细胞数在样本总卵母细胞 中所占的比例。运用Ｅｘｃｅｌ对所得数据进行无重复 双因素方差分析。 １．２．４免疫印迹 将培养后的卵母细胞移人１．５ ｍＬ离心管中； 裂解液裂解１～２ ｈ后，４℃１２ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心 １０ ｍｉｎ取上清；上清液与２Ｘ上样缓冲液等体积混 匀，水浴９５℃条件下变性ｌ０ ｍｉｎ；选用１００ Ｖ电 压，３０ ｍＡ电流ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳８０～９０ ｍｉｎ；选 用１０ ｍＡ・ｈ转膜１０ ｈ；５％脱脂奶粉封闭ｌ ｈ；添 加Ｐ—ｐ３８ＭＡＰＫ抗体（１：１ ０００），４℃孵育过夜； 添加二抗（兔ｌｇＧ）（１：２ ０００），室温孵育２—３ ｈ；用 淡水渔业 （ＧＶＢＤ）为标志的卵母细胞减数恢复中 ｐ３８ＭＡＰＫ的促进作用明显。 最近研究表明，ｐ３８ＭＡＰＫ在动物卵母细胞成 熟和减数恢复中也有调节作用。猪卵母细胞 ＧＶＢＤ发生的时候，ｐ３８ＭＡＰＫ被激活，并且其高 活性一直维持到ＭＩＩ期 。如果卵丘一卵母细胞复 合体（ｃｕｍｕｌｕｓ—ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）的ｐ３８ＭＡＰＫ活性 被抑制，『贝ｌｊ ＦＳＨ诱导的卵母细胞第一次减数分恢 复无法发生，结果提示，ｐ３８ＭＡＰＫ激活参与了猪 卵母细胞第一次减数的恢复 。在大鼠研究 巾发现，ＦＳＨ诱导颗粒细胞ｐ３８ＭＡＰＫ活性明显提 高，并导致孕酮、雌二醇和类同醇生成急性调节蛋 白（ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ ａｃｕｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＴＡＲ）水平 上升 。但ｐ３８ＭＡＰＫ被抑制后，则孕酮和ＳｔＡＲ 水平上升，而雌二醇水平下降 。ｐ３８ＭＡＰＫ被抑 制时用ＦＳＨ诱发，卵母细胞线粒体ＳｔＡＲ水平比 ＦＳＨ单独诱发（ｐ３８ＭＡＰＫ没有被抑制）时要高。因 此，ＦＳＨ激活的ｐ３８ＭＡＰＫ通路所调节孕酮和雌二 醇的方式是不同的，可能分别通过ＬＲＨ一１和 ＤＡＸ一１两个受体过程进行¨ 。本实验中，斑马 鱼卵母细胞减数恢复过程中，随着ＧＶＢＤ率 的提高，磷酸化ｐ３８ＭＡＰＫ量在增加，从而证明了 ｐ３８ＭＡＰＫ在鱼类卵母细胞成熟和减数恢复中 也有调节作用。 哺乳动物的ＦＳＨ已广泛应用在哺乳动物如牛、 羊等繁殖研究和生产上 。鱼类促性腺激素 （ＧｔＨ）同时具有促黄体激素（ＬＨ）和促卵泡激素 （ＦＳＨ）的功能 ，并在生产中也运用的较为广泛。 然而关于ＦＳＨ在鱼类卯母细胞中的机制研究 还不多见。本研究结果表明，ＦＳＨ对于卵母细胞 ＧＹＢＤ的发生有促进作用（图１），其中１ ＩＵ／ｍＬ ＦＳＨ促进作用最为明显，并且这种作用是与 ｐ３８ＭＡＰＫ的激活相关，卵母细胞减数过程中 磷酸化ｐ３８ＭＡＰＫ的量在ＦＳＨ的促进下明显增多。 本实验通过添加ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂ＳＢ２０３５８０直接 证明了这一点（图４、５）。这与曲杨燕等¨ １在绵羊 卵母细胞得到的结果类似。 有研究人员发现ＦＳＨ经由ｃＡＭＰ—ＰＫＡ通路激 活ｐ３８ＭＡＰＫ。在研究ＦＳＨ对猪卯母细胞的作用机 理时证实，通过激活卯丘细胞内ＰＫＡ信号通路的 途径，ＦＳＨ完成对猪卯母细胞成熟的调节，使胞浆 内ｃＡＭＰ的浓度迅速提高而促进卵丘细胞扩散。但 是在卵母细胞中ｃＡＭＰ浓度的下降而导致了印母细 胞减数的恢复，从而使对卵母细胞的抑制作用 得到了解除，使其具备了减数恢复的能力¨ 。 傅国栋等 引也认为ＦＳＨ可刺激卵丘细胞分泌一种 克服次黄嘌呤的物质，这种物质可能通过ＰＫＡ依 赖性通道作用于猪卯母细胞，从而诱导其成熟。 Ｍａｉｚｅｌｓ等¨ 发现，ＦＳＨ依赖ｃＡＭＰ—ＰＫＡ激活 ｐ３８ＭＡＰＫ通路，从而磷酸化大鼠小热休克蛋白２７ （ＨＳＰ２７），ＨＳＰ２７是肌动蛋白的调节蛋白，磷酸化 的ＨＳＰ２７能使肌动蛋白快速释放，形成多聚体， 使细胞骨架形成更稳定的状态，细胞形态变圆，增 加了活细胞数量。以上研究均提示无论是猪卵母细 胞成熟的调节还是大鼠强化细胞方面，ＦＳＨ在激活 ｐ３８ＭＡＰＫ过程中是依赖ｃＡＭＰ—ＰＫＡ途径的。本 实验中，通过在离体卵母细胞培养液中添加ＰＫＡ 抑制剂Ｈ８９，然后再用ＦＳＨ诱发卵母细胞减数分 裂恢复，观察到ｐ３８ＭＡＰＫ仍被激活但量很少（图 ８），同时观察到ＧＶＢＤ的不同（图６）；另一方面在 ｊ ］ ］ ］ 没有ＦＳＨ诱发时加入ＰＫＡ激动剂ｆ参 － ｏｒｓｋｏｌｉｎ，观察 ｐ３８ＭＡＰＫ能被激活，且与对照组相差明显（图８）， 从而提示鱼类的ｐ３８ＭＡＰＫ激活是ＰＫＡ依赖性的。 ］
