・７・・实验研究・ＳＤ乳鼠大脑皮层神经细胞凋亡的检测倪锦１１古妙宁２钟志勇３孙侠３饶子亮３赵士海３南方医科大学附属南方医院麻醉科（广广州市妇女儿童医疗中心儿童医院院区麻醉科（５１０１２０）；２州５１０５１５）；３广东省医学实验动物中心（广州５１０１８０）【摘要】目的探讨ＳＤ乳鼠大脑皮层神经细胞凋亡的检测方法。方法ＳＤ乳鼠５只，断头处死，取脑组ａｎｄｅｏｓＪｎ织，多聚甲醛／ＰＢＳ溶液固定，苏木素－伊红染色（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ用ＴＵＮＥＬ末端标记法（ｔｅｒｍｉｎａｌ．ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅ－ｏｔｅｄｙｌｓｔａｉｎｉｎｇ，ＨＥ）检测大脑皮层的凋亡的情况。使ｌａｂｅｌｉｎｇ，ＴＵＮＥＬ）检测大脑皮层组织的ｔｒａｎａｆｅｒａｓｅｍｅｄｉａｔｅｄｎｉｃｋｅｎｄ细胞凋亡情况，免疫组化测定大脑皮层组织ｃ踮ｐ鹊ｅ－３抗体的表达。结果大脑切片ＨＥ染色下，大脑皮层均可见少量神经细胞核固缩，计数视野面积０．２ｍｍ２下的神经细胞核固缩数是３２．２４－５．１。ＴＵＮＥＩ．末端标记法检测大脑皮层组织的细胞凋亡情况。大脑皮层神经细胞凋亡率是（６．１－Ｉ－０．７）％。免疫组化检测大脑皮层Ｃａｓｐａｓｅ・３阳性细胞计数１８．４±７．６，积分光密度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ，ＩＯＤ）是４６１８±２３１４，积分面积是１６２２４±８１５２。结论通过大脑皮层组织切片ＨＥ染色与ＴＵＮＥＬ末端标记法检测、乳鼠大脑皮层Ｃａｓｐａａｅ－３阳性细胞计数相结合，能明确地反映ＳＤ乳鼠大脑皮层神经细胞凋亡情况。【关键词】大鼠神经细胞凋亡检测ＤＯｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００—８５３５．２０１０．０１．００３不同哺乳动物出生前后脑发育高峰（ｂｒａｉｎｇｒｏｗｔｈ１．３实验对象：ＳＰＦ级新生７日龄ＳＤ乳鼠５只，体质量１２—１５ｓｐｕｒｔ）时期不同，对于大鼠而言，通常在出生前ｌ一２天开始至生后２周结束，而人类通常始于妊娠６个月至出生后数年，此期大脑神经细胞对周围环境的改变异常敏感，接触铅…、物口ｊ和酒精‘纠等因素均可能增加发育大脑神经细胞的凋亡，甚至可能引发日后的酒精综合征一１和精神症一１等神经发育异常。为此，有必要对ｓＤ乳鼠大脑皮层神经细胞发生的凋亡进行检测，我们采用大脑切片ＨＥ染色、免疫组化测定大脑皮层组织ｃ鹊ｐ酗ｅ－３抗体的表达和ＴＵＮＥＬ末端标记法检测大脑皮层组织的细胞凋亡情况相结合，用于检测ＳＤ乳鼠大脑皮层神经细胞凋亡，以期奠定研究其它因素影响ｓＤ乳鼠大脑皮层神经细胞的凋亡的基础，现将结果报道如下。１材料与方法１．１实验试剂：多聚甲醛／ＰＢＳ溶液：天津市福晨化学试剂厂，批号２００８０１１２。原位凋亡检测试剂盒：ｒｏｃｈｅｄｉａｇ－ｇ，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物许可证号：ＳＣＸＸ（粤）２００３－０００２；合格证号：２００８Ａ０２０。１．４饲养条件：ＳＰＦ级ＳＤ大鼠饲养在广东省医学实验动物中心ＳＰＦ级实验动物室，动物实验环境设施合格证号：ＳＹＸＫ（粤）２００３－０００２，室内保持２０～２５℃，湿度４０％～７０％，自由饮水、进食，水料充足，ＳＰＦ级饲料产自广东省医学实验动物中心。１．５动物实验方法：断头处死，取大脑皮层组织，多聚甲醛／ＰＢＳ溶液固定，大啮皮层切片ＨＥ染色观察凋亡情况；使用ＴＵＮＥＬ末端标记法检测细胞凋亡情况；免疫组化测定Ｃｍｐｍｅ－３抗体的表达。１．６大脑皮层切片ＨＥ染色步骤：取乳鼠的大脑皮层组织，用多聚甲醛／ＰＢＳ溶液固定，常规石蜡切片，ＨＥ染色，镜检。切片的基本制作过程是：组织取材一固定一冲洗一脱水一透明一浸蜡一组织包埋一组织切片一展片附贴一切片脱蜡一染色一染色透明一封固。１．７Ｔｕｎｎｅｌ技术测定大脑皮层组织的细胞凋亡指数：①切片加热至６０℃脱蜡入双蒸水，３％过氧化氢孵育１０ｍｉｎ，ｎｏｓｔｉｃｓｇｍｂＨ＿／ｍｃｈｅａｐｐｌｉｅｄｓｃｉｅｎｃｅ，ＲＥＦｌｌ６８４８１７９１０，Ｌｏｔ：１４４９２２０。ｃａｓｐ聃ｅ－３抗体：Ａｂｃａｎｌｐｉｅ公司产品，批号２００８０１３０。免疫组化ＳＰ试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司，批号Ｋ８６８１５Ｂ。１．２主要仪器：精度为０．１ｇ的电子天平，上海精密科学仪器有限公司，型号ＹＰＡ６００１Ｎ；精度为０．０ｌｇ的电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号ＢＳ２２３Ｓ。荧光成像系统显微镜：奥林巴斯，型号：ＢＸ４１。ＰＢＳ洗２ｍｉｎ，重复洗２次。②微波修复：０．１Ｍ枸橼酸缓冲液（ｐＨ６．０），中高火微波５ｍｉｎ，静置１０ｍｉｎ。其中阳性对照片经１０Ｕ／ｒａｉｎＤＮ鹅ｅＩ处理１０ｍｉｎ。ＰＢＳ洗２ｍｉｎ，加入封闭液５０∥片，２０ｍｉｎ。③在冰盒中吸取１００一试剂２（ＬａｂｅｌＳｏｌｕｔｉｏｎ），放入一个新的离心管。把５０恤ｌ试剂基金项目：广州市医药卫生科技项目（２００７一ＹＢ－０６０），广州市中医药中西医结合项目（２００９Ａ０２６）作者简介：倪锦（１９７２．），男，副主任医师，硕士学位，南方医科大学在职博士研究生，主要从事物对动物和人发育脑组织的毒性影响的研究万方数据 ・８・ｌ（ＥｎｚｙｍｅＳｏｌｕｔｉｏｎ）加入试剂２的管内，混匀。④去除封闭液，阴性对照滴人５０山试剂２，阳性对照和其他片加５０ｍ混合液，盖上封口膜，３７℃孵育６０ｍｉｎ。ＰＢＳ洗５ｍｉｎ，重复洗３次。⑤加５０仙ｌ试剂３（Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ－ＰＯＤ），盖上封口膜，３７℃孵育３０ｍｉｎ。ＰＢＳ洗４ｍｉｎ，重复洗３次。加入１滴ＤＡＢ显色液显色２～１０ｍｉｎ，镜下观察最佳作用时间。⑥蒸馏水冲洗，苏木素复染，水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。⑦选择有代表性的５个高倍视野，计数５００个细胞中染上棕黄色核的阳性细胞数。１．８免疫组化检测大脑皮层组织的Ｃａｓｐａｓｅ－３抗体的表达：脱蜡和水化：①组织玻片切片置于二甲苯中浸泡５ｍｉｎ；②更换二甲苯后再浸泡５ｍｉｎ；③９５％乙醇中浸泡５ｍｉｎ；④９５％乙醇中浸泡５ｍｉｎ；⑤蒸馏水冲洗，浸泡５ｍｉｎ，再冲洗ｄ抗原修复：ＥＤＴＡ溶液（１：５０蒸馏水热修复，在电炉里加热至沸腾后１５ｍｉｎ。阻断内源性过氧化物酶：３％Ｈ：Ｏ：滴加，室温静置１０ｍｉｎ。免疫组织化学染色：①滴加Ｉ抗，每张切片加１滴或５０Ｕ，恒温箱３７℃ｌｈ；②ＰＢＳ洗３次，各洗２ｍｉｎ；③滴加Ⅱ抗（山羊抗鼠ＩｇＧ抗体－ＨＲＰ多聚体），每张切片加１滴或５０Ｕ，恒温箱３７℃２５ｒａｉｎ；④ｅａｓ洗３次，各洗２ｒａｉｎ；⑤ＤＡＢ显色，每张切片加１滴或５０Ｕ，５～ｉｏｍｉｎ，在显微镜下掌握显色程度；⑥自来水冲洗１０ｍｉｎ；⑦苏木精复染２ｍｉｎ，盐酸酒精分化１０Ｂ；⑧碳酸锂反蓝１０８；⑨脱水、透明、封片、镜检。２结果２．１ＳＤ乳鼠的大脑皮层切片ＨＥ染色：检测５只ＳＤ乳鼠大脑皮层，大脑皮层均可见少鼍神经细胞核固缩（见图１），计数视野面积０．２ｍｍ２下的神经细胞核固缩数是３２．２±５．１。图１ＳＤ乳鼠的大脑皮层切片ＨＥ染色检测凋亡（箭头所示为凋亡细胞）２．２ＴＵＮＥＬ末端标记法检测大脑皮层组织的细胞凋亡情况：计数５例ＳＤ乳鼠大脑皮层５００个细胞中染上棕黄色核的阳性细胞数（见图２），ＳＤ乳鼠大脑皮层细胞凋亡率是（６．１４－０．７）％。２．３免疫组化检测ＳＤ乳鼠大脑皮层Ｃａｓｐａｓｅ－３阳性细胞计万 方数据数：观察视野０．１２ｍｎｌ２下，５例ＳＤ乳鼠大脑皮层Ｃａｓｐａｓｅ．３阳性细胞（见图３）计数１８．４４－７．６，积分光密度（Ｉｎｔｅ．ｇｒａｔｅｄＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ，ＩＯＤ）４６１８４－２３１４。积分面积１６２２４４－８１５２。图２ＴＵＮＥＬ末端标记法检测ＳＤ乳鼠的大脑皮层的凋亡（箭头所示为凋亡细胞）图３免疫组化检测ｓＤ乳鼠大脑皮层Ｃａｓｐａｓｅ－３阳性细胞（箭头所示为Ｃａｓｐａｓｅ－３阳性细胞）３讨论神经系统发育是一个极其复杂的生物学过程，涉及到神经细胞和神经胶质细胞的发生、增殖、迁移、决定、分化、细胞凋亡、突触形成以及神经网络和核团等三维构筑的形成曲１。细胞凋亡普遍存在于个体发育过程中，神经系统的发育也不例外。细胞凋亡是细胞的一种生理性死亡形式，在机体的特定部位及发育的特定时间按一定的基因表达顺序发生，因此又称程序性细胞死亡（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｅｅｌｌｄｅａｔｈ，ＰＣＤ）。细胞凋亡与细胞增殖同等重要，二者的动态平衡保证了神经系统的正常发育＂Ｊ。ＨＥ染色法对凋亡细胞的形态学特征检测，既方便又可靠，在一般普通光学显微镜下就可进行观察与检测．此法不失于研究细胞凋亡的一种检测观察凋亡细胞形态学特征的简便方法。ＨＥ染色法镜下。凋亡细胞的细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色，正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。细胞凋亡中，染色体ＤＮＡ双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性３’．ＯＨ末端，可在脱氧核糖核昔酸末端转移酶（ＴｄＴ）的作用下，将脱氧核糖核昔酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到ＤＮＡ的３’・末端。从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核昔酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（ｔｅｒｍｉｎａｌ—ｄｅ—ｏｘｙｎｕｅｌｅ・ｏｔｅｄｙｌｔｒａｎａｆｅｒａｓｅｍｅｄｉａｔｅｄｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ，ＴＵＮＥＬ）ＬＳＪ。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有ＤＮＡ的断裂，因而没有３’．ＯＨ形成，很少能够被染色。ＴＵＮＥＬ实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞。ＴＵＮＥＬ法可显示凋亡细胞的形态和分布，这是其他检测方法所不及的归Ｊ。ＴＵＮＥＬ广泛用于检测ＤＮＡ碎片片段，该方法具有操作简单、结果特异性强、重复性好等特点，特别对于低水平凋亡检测更敏感。Ｃａｓｐａｓｅ在介导细胞凋亡过程中起着非常重要的作用，其中Ｃａｓｐａｓｅ－３为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能，因而它是凋亡的生物标记物¨…。Ｃａｓｐａｓｅ－３正常以酶原（３２ｋｕ）的形式存在于细胞浆中，在细胞凋亡的早期阶段被激活，活化的Ｃａｓｐａｓｅ一３由２个大亚基（１７ｋｕ）和２个小亚基（１２ｋｕ）组成。裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和坏死细胞中，Ｃａｓｐａｓｅ一３的活性较低。由于触发凋亡的因素众多…Ｊ，其中包括细胞生长因子丧失、ＤＮＡ损伤后的继发因素、体液因素、缺氧或肿瘤坏死因子，检测Ｃａｓｐａｓｅ－３活性细胞为探讨细胞凋亡的机制也提供了一条途径。综上所述，结合本组资料表明，通过ＳＤ乳鼠大脑皮层的病理切片ＨＥ染色、ＴＵＮＥＬ末端标记法检测与免疫组化检测Ｃａｓｐａｓｅ－３阳性细胞计数相结合，可明确反映ＳＤ乳鼠大脑皮层神经细胞凋亡的情况，将为研究其它因素影响ＳＤ乳鼠大脑皮层神经细胞的凋亡奠定基础。参考文献：［１］ＨａｎＪＭ，ＣｈａｎｇＢＪ，ｕｒｌＥ，ｅｔａ１．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆ瓣ｅｏｒｂｉｅａｃｉｄａｇａｉｎｓｔｌｅａｄ・・ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｔｉｅｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａ—－ｔｉｏｎｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｒａｔｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｉｎｖｉｖｏ［Ｊ］．万 方数据・９・ＢｒａｉｎＲｅｓ，２００７，１１８５：６８－７４．［２］ＺｏｕＸ，ＰａｔｔｅｒｓｏｎＴＡ，ＳａｄｏｖｏｖａＮ。ｅｔａ１．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｎｅｕ・ｒｏｔｏｘｉｅｉｔｙｏｆｋｅｔａｍｉｎｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｒａｔｂｒａｉｎ［Ｊ］．ＴｏｘｉｅｏｌＳｃｉ，２００９，１０８（１）：１４９．１５８．［３］ＹｏｕｎｇＣ，ＳｔｒａｉｋｏＭＭ，ＪｏｈｎｓｏｎＳＡ，ｅｔａ１．Ｅｔｈａｎｏｌ咖一８ｅ８ａｎｄｌｉｔｈｉｕｍｐｒｅｖｅｎｔｓｎｅｕｒｏａｐｏｐｔ０６ｉｓａｎｄｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐＥＲＫｉｎｔｈｅｉｎｆａｎｔｍｏｕｓｅｂｒａｉｎ［Ｊ］．ＮｅｕｒｏｂｉｏｌＤｉｓ，２００８，３１（３）：３５５－３６０．［４］ＪｏｓｈｉＳ，ＧｕｌｅｒｉａＲＳ，ＰａｎＪ，ｅｔａ１．ＥｔｈａｎｏｌｉｍｐａｉｒｓＲｈｏＧＴＰａｓｅｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｅｅｒｅｂｅｌｌａｒｇｒａｎｕｌｅｎｅｕｒｏｎｓｉｎａｒｏｄｅｎｔｍｏｄｅｌｏｆｆｅｔａｌａｌｃｏｈｏｌｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．ＣｅｌｌＭｏｌＬｉｆｅＳｃｉ，２００６，６３（２３）：２８５９－２８７０．［５］ＫａｌｉｎｉｅｈｅｎｋｏＳＧ，ＭａｔｖｅｅｖａＮＹ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｅｈａｒａｅ—ｔｅｒｉｓｔｉｅｓｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｅｅｉｎｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．ＮｅｕｒｏｓｃｉＢｅｈａｖＰｈｙｓｉｏｌ，２００８，３８（４）：３３３—３４４．［６］ＤｉｃｏｕＥ．Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉａｓａｎｄｎｅｕｒｏｎａｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｄｅ—ｖｅｌｏｐｉｎｇｒｏｄｅｎｔｂｒａｉｎ［Ｊ］．ＢｒａｉｎＲｅｓＲｅｖ，２００９，６０（２）：４０８－４１７．［７］ＹａｗｎｏＴ。ＨｉｒｓｔＪＪ，Ｃａｓｔｉｌｏ—ＭｅｌｅｎｄｅｚＭ，ｅｔａ１．Ｒｏｌｅｏｆｎｅｕｒｏｓｔｅｒｏｉｄｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｃｅｌｌｄｅａｔｈａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｌａｔｅｇｅｓｔａｔｉｏｎｆｅｔａｌｂｒａｉｎ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１６３（３）：８３８—８４７．［８］ＭａｔａｓｓｏｖＤ，ＫａｇａｎＴ，ＬｅｂｌａｎｅＪ，ｅｔａ１．ＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉ・Ｏｌ，２００４，２８２：１—１７．［９］ＢａｒｔｈＭ，ＯｕｌｍｉＹ，ＥｈｒｅｎｒｅｉｅｈＨ，ｅｔａ１．Ｐｒｅ・ｅｍｂｅｄｄｉｎｇｉｍｍｕｎｏｇｏｉｄｌａｂｅｌｉｎｇｏｆＴＵＮＥＬｓｔａｉｎｅｎａｂｌｅｓｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓａｎｄｕｈｒａｓｔｒｕｅｔｕｒａｌａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｉｎｄｉ．ｖｉｄｕａｌｃｅｌｌｓｏｆｎｅｕｒｏｎａｌｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．ＡｃｔａＮｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ，２００２，１０４（６）：６２１－６３６．［１０］Ａｂｕ－Ｑ啪ＡＷ，Ａｂｏｕ—ＤｏｎｉａＭＢ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｏｆａｐｏｐｔｏ－ｓｉｓ：ｒｅｌｅａｓｅｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｃａｓｐａｓｅ－３，ｉｎ—ｄｕｅｔｉｏｎｏｆ８－ｈｙｄｒｏｘｙ－２＇－ｄｅｏｘｙｇｒｕａｎｏｓｉｎｅ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ３－ｎｉ—ｔｒｅｔｙｒｏｓｉｎｅ、，ａｎｄａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｐ５３ｇｅｎｅ［Ｊ］．ＪＴｏｘｉｃｏｌＥｎｖｉｒｏｎＨｅａｌｔｈＢＣｒｉｔＲｅｖ，２００１，４（３）：３１３－３３２．［１１］ＪｉｎＺ，Ｅｌ—ＤｅｉｔｙＷＳ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｃｅｌｌｄｅａｔｈｓｉｓｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌＴｈｅｒ，２００５，４（２）：１３９－１６３．（收稿日期：２００９—１１—２３）
