酶法水解对黄芪提取物清除DPPH自由基能力的影响

酶法水解对黄芪提取物清除DPPH自由基能力的影响

【摘要】：黄芪是一种传统中药，为豆科多年生草本植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，性温，味甘，有补气固表，利尿托毒，敛疮生肌，益气补中之功效要用于食少便塘，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，气虚水肿，子宫脱垂，慢性肾炎蛋白尿，糖尿病，创口久不愈合，是临床常用中药【1】。

黄芪异黄酮主要以糖苷类型的分子形式存在于黄芪中, 但是其具有生物活性的部分主要是苷元【2】。为了建立一种体外生物转化黄芪异黄酮糖苷为黄芪异黄酮苷元的新方法, 采用纤维素酶水解70 %乙醇提取脱脂黄芪得到的异黄酮粗提物, 对比了水解前后两样品的异黄酮组成差异, 并测定了其清除DPPH 自由基的能力。结果表明: 纤维素酶能水解黄芪苷。纤维素酶处理以后的黄芪异黄酮糖苷混合物达到DPPH 自由基清除率高于未处理的黄芪异黄酮糖苷混合物【3】。 【关键字】：异黄酮; 黄芪; 抗氧化活性; 自由基;

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The effect of Enzymatic hydrolysis on the ability of astragalus extract cleared free radical of DPPH

【Abstract】: Radix astragali is the roots of Astragalus membranaceus(Fisch．)Bge．vat．mongholicus(Bge．)Hsiao，or Astmgalus membranaceus(Fisch．)Bge．，known as Huangqi in China,which belong to Family Leguminosae and is a perennial herb growing in the northeast，northwest and southwest of China．Radix astragali is the most important tonic in the Traditional Chinese Medicine to reinforce”qi”(vitalegergy)，to strengthen the superficial resistance，and to promote the discharge of pus and the growth of new tissue．It has long been used as an anti—perspirant,adiuretic of atonic．It is widespread used in clinical treatment．

Isoflavones occurred in radix astragali are mainly as glycosides.

However, their bioactivities lie in the aglycones.Cellulase was used to convert isoflavone glycosides extracted fromdefatted soyean meal with 70 % ethanolinto the aglycones in this study. The compositions and antioxidant capacity of isoflavone extract before and after cellulase treatment were analyzed by HPLC and DPPH free radical scavenging test. The results showed daidzin and genistin could be hydrolyzed into daidzein and genistein by cellulase. But the hydrolysis of malonyl daidzin and malonyl genistin could not be found. The concentration of cellulase treated radix astragali isoflavone extract for DPPH free radical scavenging rate was high than non cellulase treated radix astragali isoflavone extract.

【Key words】: isoflavone; radix astragali; antioxidant activity; free radical; cellulose

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目录

第一章 前言 ............................................................ 5

1.1黄芪简介 ........................................................ 5

1.1.1黄芪基本介绍 ............................................... 5 1.1.2黄芪特性 ................................................... 6 1.1.3植物形态 ................................................... 6 1.1.4黄芪特征 ................................................... 6 1.1.5黄芪的功效 ................................................. 6 1.1.6黄芪药材资源 ............................................... 7 1.2黄芪的主要化学成分 .............................................. 8

1.2.1黄芪多糖 ................................................... 8 1.2.2皂苷类成分 ................................................. 9 1.2.3黄酮类成分 ................................................. 9 1.2.4氨基酸 .................................................... 11 1.2.5其他 ...................................................... 11 1.3.异黄酮简介 ..................................................... 11

1.3.1异黄酮基本介绍 ........................................... 11 1.3.2理化性质 ................................................. 12 1.3.3鉴别反应 ................................................. 12 1.3.4分布特点 .................................................. 13 1.4酶简介 ......................................................... 14

1.4.1酶的基本介绍 .............................................. 14 1.4.2酶的特性 ................................................. 14 1.4.3酶促反应 .................................................. 15 1.5纤维素酶简介 ................................................... 15

1.5.1纤维素酶基本介绍 .......................................... 15 1.5.2纤维素酶的组成与功能 .................................... 16 1.5.3纤维素酶降解纤维素的机理研究 ............................ 16 1.6大孔吸附树脂分离原理 ........................................... 17 1.7抗氧化性的作用 ................................................. 17 第二章 实验 ........................................................... 18

2.1实验材料与设备 ................................................. 18

2.1.1 材料 ..................................................... 18 2.1.2设备 ...................................................... 18

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2.2实验方法 ....................................................... 18

2.2.1工艺流程 .................................................. 18 2.2.2实验过程 ................................................. 18 2.3黄芪提取物DPPH自由基的清除 ................................... 19

2.3.1自由基的作用 .............................................. 19 2.3.2清除DPPH 自由基能力的测定原理 ............................ 20 2.3.3清除DPPH 自由基能力的测定方法 ............................ 21

第三章 结果与讨论 ..................................................... 22

3.1数据记录与计算 ................................................. 22 3.2DPPH 自由基清除率的计算 ......................................... 22 3.3实验讨论 ....................................................... 26 3.4实验结果 ....................................................... 26 第四章 结论 ........................................................... 27 致谢 .................................................................. 28 参考文献 .............................................................. 29

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第一章 前言

黄芪是豆科植物，它是一味常用的中药。它的主要药理作用是“益气固表”，可以“利水”，也可以“托毒生肌”。什么是“益气”呢？凡是中医认为是“气虚”、气血不足”、“中气下陷”的情况，都可以用黄芪【4】。体质虚弱，容易疲劳，常感乏，往往是“气虚”的一种表现。贫血，则常属“气血不足”。而脱肛、子宫下坠这些病状也常被认为是“中气下陷”。有上述症状的人，冬令吃些黄芪有益处。当然最好是在医生的指导下服用。

有些人一遇天气变化就容易感冒，中医学称为“表不固”，可用黄芪来固表。常服黄芪可以避免经常性的感冒。中医有一个有名的方子，叫“玉屏风散”，有三味药，主药就是黄芪，是可以用来治疗经常性感冒的。

因为身体虚弱，或者年纪大了的人，往往下肢有些水肿。如果属于“气虚”，也可以常服黄芪。有慢性肾病的人，也可能常有浮肿，中医治疗时，黄芪有时也是常用的中药。

黄芪有益气固表、敛汗固脱、托疮生肌、利水消肿之功效。用于治疗气虚乏力，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，痈疽难溃，久溃不敛，血虚萎黄，内热消渴，慢性肾炎，蛋白尿，糖尿病等。炙黄芪益气补中，生用固表托疮。

本文利用黄芪为实验材料, 采用DPPH 自由基法对黄芪黄酮的清除自由基活性进行了研究, 以期为黄芪的合理开发利用提供参考依据, 为从天然植物材料中寻求生物活性成分提供一条新的途径。

1.1黄芪简介

1.1.1黄芪基本介绍

黄芪，又名黄耆，为植物和中药材的统称。植物黄芪产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地，为国家三级保护植物。中药材黄芪为豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的根，具有补气固表、利水退肿、托毒排脓、生肌等功效。黄芪的药用迄今已有2000多年的历史，现代研究，黄芪含皂甙、蔗糖、多糖、多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素【5】。有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。但表实邪盛，气滞湿阻，食积停滞，痈疽初起或溃后热毒尚盛等实证，以及阴虚阳亢者，均须禁服。

黄芪(耆)素以“补气诸药之最”著称，是一种名贵的中药材，也是一种最常用中药材。中文名黄芪huang qi含义为\"黄色的头\"(\"yellow leader\") ，意指其药材根的黄颜色和至要的补药。《中国药典》收载的黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的

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干燥根。

1.1.2黄芪特性

黄芪分布于我国温带和暖温带地区，为深根性植物。喜凉爽气候，有较强的抗旱、耐寒能力，不耐热，不耐涝。气温过高常抑制植株生长，土壤湿度过大，常引起根部腐烂。宜在土层深厚、肥沃、疏松、排水良好的砂质土壤生长，在粘土上则根多，生长缓慢。多生于林缘、灌丛、林间草地、疏林下及草甸等处【6】。花期7～8月，果期8～9月。 1.1.3植物形态

黄芪为多年生草本，株高1米左右。主根直径1～2厘米，长可达1米以上，直插入土壤深处。地上茎直立，具棱；被长毛。叶互生，奇数羽复叶，具小叶21～31片。小叶椭圆形，长7～30毫米，宽4～12毫米，先端圆或微凹，基部圆形。托叶披针形，长6毫米。总状花序生茎上部叶腋，每花序10～20朵。花淡黄色，蝶形花冠，旗瓣倒卵形，顶端微凹，翼瓣与龙骨瓣近等长。子房有柄，花后荚果膨胀，长圆形，长2～3厘米，顶端有短喙，果外被短毛，内有种子3～8粒。 1.1.4黄芪特征

黄芪直根圆柱形、有的有分枝，上端较粗，长30～90厘米,直径1～3.5厘米，表面纵皱色淡棕黄色或淡棕褐色，有不整齐的纵皱纹或纵沟质，硬而韧有粉性，皮部黄白较疏松；木部菊花纹理状，气似豆腥味微甜。老根中心偶有枯朽状,黑褐色或呈空洞。气微,味微甜，嚼之微有豆腥味。质量以根条粗长、菊花心鲜明、空洞小、破皮少者为佳；红芪以皮色红润、根条均匀、坚实、粉性足者为佳。规格一般按粗细、长短分为三个等级。

红芪为野生，根呈圆柱形，大多为直条状，少有分枝，上端略粗，下端渐细，长10-50cm ，直径0.6-2cm；表面灰红棕色，具纵皱纹及少数支根痕，栓皮易脱落而露出淡黄色的皮部及纤维；皮孔横长，色浅，黄色或暗黄色，略突出；质硬而韧，不易折断，断面显纤维性并显粉性；横切面皮部黄白色约占半径1/2-1/3，形成层淡棕色，木质部淡黄棕色具放射状纹理；气微，味甜，嚼之有豆腥味【7】。特征可概括为： 红芪单根圆柱形，上粗下细色红棕；质硬而韧富粉性，皮部黄白较疏松；气微味甜豆腥味，补气固表治疽痈。 1.1.5黄芪的功效

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黄芪性微温，味甘，有补气固表、止汗脱毒、生肌、利尿、退肿之功效。用于治疗气虚乏力，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，痈疽难溃，久溃不敛，血虚萎黄，内热消渴，慢性肾炎，蛋白尿，糖尿病等。炙黄芪益气补中，生用固表托疮。

黄芪和人参均属补气良药，但人参偏重于大补元气，回阳救逆，常用于虚脱、休克等急症，效果较好【8】。而黄芪则以补虚为主，常用于体衰日久、言语低弱、脉细无力者。黄芪具而补而不腻的特点，若与人参，党参等补药配伍则效果更好。黄芪可单味使用，也可与其它药物配伍应用，与芍药、甘草、桂枝、良姜、饴糖等药配伍可以治疗脾胃虚寒、慢性肠炎、胃炎、腹泻等症；与升麻、甘草、当归、人参、柴胡等药物配伍可治疗内脏下垂、脱肛、子宫下垂等症；与茯苓、菟丝子、白术、当归等配伍是治疗妇科良药；与防风、麻黄根、浮小麦配伍是治疗年老体弱者所患表虚感冒的良药。由于黄芪而补气利尿、消肿等功效，与茯苓、薏苡仁、防己等药配伍时又是治疗急慢性胃炎的良药【9】。又因黄芪具而托毒、生肌的功能，在治疗疔疮及慢性阑尾炎等疾病时也常常选用黄芪治疗。 现代医学研究表明，黄芪内含而多种抗菌有效成分，而且能增强机体的免疫功能，因此还能用于预防某些传染病的发生。无论从中医治疗，还是现代医学观察，黄芪均是一味好药。所以，民间自古就有“冬令取黄芪配成滋补强身之食品”的习惯。

黄芪根入药，常作滋补中药，又可作兽药，销售量大。根茎之10倍水浸液，对马铃薯晚疫有抑制效率。黄芪还有保持水土的作用。 1.1.6黄芪药材资源

药典规定黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜英黄茂的干燥根闭。而其同属近缘植物在有些地区亦被作为黄芪入药。该属植物约种, 分布于除大洋洲外的世界亚热带和温带地区。我国有种以上, 主产于东北, 经北部、西北而至西南, 可充黄芪作药用者有十种左右, 如下表一所示。除上述的植物资源外, 各地均有引种栽培。另外, 实验证明黄芪地下部分和地上部分各成分的药理作用只是强弱不同, 而效果是一致的, 因而有可能将地上部分作为地下部分的代用品, 最近黄芪的组织培养成功为扩大黄芪资源开辟了一条新的可能的途径。

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1.2黄芪的主要化学成分

自七十年代以来，国内外对黄芪及其同属近缘植物中的化学成分进行了大量的研究。研究表明，黄芪的化学成分主要为多种黄酮类和三萜皂苷类化合物【10】。另外还有单糖、多糖、氨基酸等。 1.2.1黄芪多糖

黄芪多糖主要有葡聚糖和杂多糖，其中葡聚糖又有水溶性葡聚糖和水不溶性葡聚糖，黄芪中所含的杂多糖多为水溶性酸性杂多糖，主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，糖醛酸含量少，由半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，而有些杂多糖仅由葡萄糖和阿拉伯糖组成。

黄芪多糖的研究已取得一定进展，其多糖含量处于中上水平。国内学者从黄芪中分离纯化得到白色粉末状多糖，分子量37ku，鉴定为仅一糖苷键结构，多糖水解后检出葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，摩尔比为1：0．95：0．70。秦雪梅等采用酚一硫酸比色法测定了内蒙黄芪地下与地上部分黄芪多糖的含量，测得根部含量最高，茎叶次之，种子最低。由于茎叶产量大，易采收，是很好的黄芪多糖药源【11】。徐凌川口。用分光光度法测定不同来源的黄芪药材多糖的含量，结果发现文登和新泰黄芪基地所产黄芪的黄芪多糖含量分别为8．62％和14．15％，表明了黄芪药材多糖含量的差异

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性。张善玉¨1等应用比色法测定不同生长年限黄芪的多糖含量，结果发现，生长年限为1、2、3年的黄芪多糖含量分别为32．12、23．42、16．68mg／g，表明随着生长年限的增加，黄芪中多糖的含量逐年降低。 1.2.2皂苷类成分

皂苷类为黄芪中重要的有效成分。目前从黄芪及其同属近缘植物中已分离出加多种皂苷，主要有黄芪皂苷I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V、Ⅵ、Ⅶ，异黄芪皂苷I、Ⅱ、Ⅲ及黄芪皂苷I等。除黄芪皂苷I、黄芪皂苷Ⅷ外，其余均以9，19一环羊毛脂烷型的四环三萜皂苷类为苷元，总称为黄芪皂苷或黄芪总皂苷。潘飞等一1用分光光度法对蒙古黄芪总皂苷含量的动态实验表明：5月初苗期含量最低，此后随着植物生长其含量逐渐上升，至9月达到最高峰，以后逐渐下降。不同种黄芪间总皂苷含量有所差异，金翼黄芪、东俄洛黄芪、单蕊黄芪的总皂苷含量较高，多花黄芪、蒙古黄芪、膜荚黄芪及其青海变种含量居中，马衔山黄芪和多序岩黄芪含量较低。江燕等”1对黄芪药材中黄芪甲苷和总皂苷含量的比较，采用HPLC法测定黄芪甲苷的含量，采用紫外分光光度法测定黄芪总皂苷的含量，并考察两者的相关性。结果黄芪甲苷含量为0．13—1．53mg／g，黄芪总皂苷含量为7．5～17．2mg／g。表明不同产地黄芪药材中黄芪甲苷和总皂苷含量的差异较大，两种含量之间存在相关性。梁伟∞o用药典法测定不同产地及药用部位黄芪的黄芪甲苷的含量，结果发现产地和用药部位的不同，其黄芪甲苷含量亦不同。不同产地黄芪甲苷含量排列顺序为：甘肃>黑龙江>陕西>内蒙>宁夏>青海>山西>山东>河北；相同产地不同用药部位的黄芪，其黄芪甲苷含量均为细根(侧根)高于粗根(主根)。张善玉等。采用比色法测定黄芪中总皂苷的含量，薄层扫描法测定黄芪中黄芪甲苷的含量，结果1、2、3年生黄芪中总皂苷的含量分别为0．793、0．803、0．991mg／g、黄芪甲苷分别为0．163、0．170、0．203mg／g，结论表明，随着生长年限的增加，黄芪中总皂苷和黄芪甲苷的含量都在升高。 1.2.3黄酮类成分

黄酮类成分多达30余种，主要有槲皮素、山奈黄素、异鼠李素、鼠李异柠檬素、羟基异黄酮、异黄烷、芦丁、芒柄花素、毛蕊异黄酮等。赵明等首次对贺兰山黄芪的根进行了系统的化学成分研究，从中分离得到3种异黄烷和1种异黄酮类成分。运用层析手段和波谱解析分别鉴定为：Pendulone(化合物1)、Isomucmnulatol(化合物2)、2’，4'-Dimethoxy-3'-hydroxyisoflavan-6一O一8一gluco—pyranoside(化合物3)和Santal(化合物4)。化合物3为新化合物，化合物1、4在黄芪属植物中首次被发现。王利平{驯等通过冷浸、回流提取、超声提取法分别对山西浑源5年和6年生黄芪中水溶物、槲皮素、5-0一甲基维斯阿米醇苷及芒柄花素进行了提取分离，并进行了含量比较，采用ZorbaxSB．C18色谱柱，以甲醇一0．4％H3PO,(V：V=50：50)

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为流动相，流速为1．0ml／min，在254nm处同时测定了槲皮素、5—0．甲基维斯阿米醇苷及芒柄花素的含量【12】。结果表明：5年生黄芪中的水溶性物质含量高于6年生黄芪，且均高于药典要求值，采用相同的提取方法时5年生黄芪中的5-0一甲基维斯阿米醇苷含量高于6年生黄芪，而6年生黄芪中的槲皮素和芒柄花素的含量高于5年生黄芪。张善玉等采用比色法测定不同生长年限的黄芪中总黄酮的含量，结果发现l、2、3年生的黄芪总黄酮含量分别为0．303、0．353、0．527mg／g，表明不同生长年限的黄芪中，总黄酮的含量随着年限的增长而增加。陈鑫等以芦丁为对照，采用紫外分光光度法测定黄酮含量，得到不同产地黄芪总黄酮含量：河北5．51l r119／g，山西5．391mg／g，吉林5．300mg／g，甘肃4．755mg／'g，内蒙4．737mg／g，陕西4．404mg／g，青海3．472mg／g。结论是不同产地黄芪总黄酮含量存在明显差异。从样本数据的均值分析，总黄酮含量由高到低依次为河北、山西、吉林、甘肃、内蒙、陕西、青海。白雪梅等引通过HPLC方法，并对不同产地黄芪中山柰素的含量进行分析，采用YWG—C18色谱柱(4．6mm×250mm，101山m)，以甲醇与0．4％磷酸水溶液(70：30)溶剂洗脱，检测波长375nm，柱温30℃，流速1．0ml／min，进样量201．LL。结果发现，不同产地的黄芪山柰素的含量相差较大。

表二.黄酮类化合物的结构式

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1.2.4氨基酸

黄芪中含有氨基酸共25种，如1一氨基丁酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等。赵复中等⋯1从营养学角度，应用氨基酸自动分析仪对膜荚黄芪中所含氨基酸进行全面分析，分析结果：结合氨基酸8．05％，游离氨基酸0．38％，总氨基酸8．43％。除色氨酸未分析外，含有所有人体必需氨基酸，说明膜荚黄芪除具有药效外，还有丰富的营养价值。吴耕农等I”1将黄芪茎经适当提取分离后，采用6300氨基酸自动分析仪测定其游离氨基酸、结合氨基酸的成分及含量。结果发现，黄芪茎含有17种氨基酸，其中游离氨基酸含量为0．3482％，结合氨基酸总含量为7．035l％。结论为黄芪茎中含有丰富的氨基酸，可以作为药材很好的开发利用。毛泉明等纠对黄芪经适当提取分离后，用6300氨基酸自动分析仪测定游离氨基酸含量，检测波长kl=570nm，X2=440nm；柱温50～77℃。游离氨基酸总含量：云南栽培黄芪为1．7343％，梭果黄芪为0．5608％，金翼黄芪为0．3741％。结果得出游离氨基酸含量云南栽培黄芪最高，金翼黄芪最低。 1.2.5其他

黄芪中还含有微量元素、甾醇类物质、叶酸、亚麻酸、亚油酸、甜菜碱、胆碱、咖啡酸、香豆素、尼克酸、核黄素、维生素P、淀粉E等。

1.3.异黄酮简介

1.3.1异黄酮基本介绍

异黄酮，是植物苯丙氨酸代谢过程中，由肉桂酰辅酶A侧链延长后环化形成以苯色酮环为基础的酚类化合物，其3-苯基衍生物即为异黄酮，属植物次生代谢产物。

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类黄酮属，是一种芳香族含氧杂环化合物，黄酮的异构体

【13】

。精制的异黄酮呈片状

或针状结晶。一般无色，但随着羟基的增加，可呈黄至深黄色。为广泛分布于高等植物的色素。有些异黄酮是植保素，有些可用于心血管病的治疗。

图1 异黄酮的结构式

1.3.2理化性质

黄酮类化合物多为结晶性固体，少数为无定型粉末。黄酮类化合物的颜色与分子中存在的交叉共轭体系及助色团（-OH、-CH3）等的类型、数目及取代位置有关。一般来说，黄酮、黄酮醇及其苷类多呈灰黄至黄色，查尔酮为黄色至橙黄色，而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类等因不存在共轭体系或共轭很少，故不显色。花色素及其苷元的颜色，因pH的不同而变，一般呈红（pH<7）、紫（7<8.5）、蓝（PH>8.5）等颜色。黄酮苷元一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，易溶于稀碱液。黄酮类化合物的羟基糖苷化后，水溶性相应加大，而在有机溶剂中的溶解度相应减少。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶等溶剂，难溶于乙醚、三氯甲烷、苯等有机溶剂。黄酮类化合物因分子中多有酚羟基而呈酸性，故可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。有些黄酮类化合物在紫外光（254nm或365nm）下呈不同颜色的荧光，氨蒸汽或碳酸钠溶液处理后荧光更为明显。多数黄酮类化合物可与铝盐、镁盐、铅盐或锆盐生成有色的络合物。 1.3.3鉴别反应

（1）盐酸-镁粉还原反应

取药材粉末少许与试管中，用乙醇或甲醇数毫升温浸提取，取提取液加镁粉少许振摇，滴加几滴浓盐酸，1-2min内即出现颜色。多少黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类显红-紫红色，黄酮类显橙色，异黄酮及查尔酮类无变化。其他还原反应还有：

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盐酸-锌粉反应，黄酮、黄酮醇类常不显色，只有二氢黄酮醇类可被锌粉还原呈深红色；钠-汞齐反应，黄酮类成分可产生黄、橙、红等色；四氢硼钠（钾）反应，仅二氢黄酮醇类可被四氢硼钠还原呈红色，其他黄酮类不反应。 （2）金属盐类试剂络合反应

黄酮类成分和铝盐、镁盐、铅盐、锆盐等试剂反应，生成有色的络合物，可供某些类型黄酮的鉴别。产生络合作用的条件是黄酮类成分必须具备下列条件之一，如5-羟基、3-羟基或邻二羟基。根据有色络合物的最大吸收波长，可进行定量测定。常用的试剂有三氯化铝、醋酸铅、醋酸镁与二氯氧化锆等试剂。 1.3.4分布特点

黄酮类化合物在植物体内的形成，是由葡萄糖分布经过莽草酸途径和乙酸-丙二酸途径生成羟基桂皮酸和三个分子的乙酸，然后合成查尔酮，再衍变为各类黄酮类化合物。

（1）黄酮类及二氢黄酮类

黄酮类广泛分布于被子植物中，以芸香科、菊科、玄参科、伞形科、苦苣苔科及豆科植物中存在较多；二氢黄酮类分布较普遍，尤其在被子植物的蔷薇科、芸香科、姜科、菊科、杜鹃花科和豆科中分布较多【14】。

（2）黄酮醇类及二氢黄酮醇类

黄酮醇类较广泛地分布于双子叶植物，特别是一些木本植物的花和叶中，以山柰酚和槲皮素最为常见；二氢黄酮醇类存在于裸子植物、单子叶植物姜科的少数植物中，双子叶植物中分布较普遍，在豆科、蔷薇科植物中也较多。

（3） 查尔酮类

大多分布在菊科、豆科、苦苣苔科植物中，在玄参科、败酱科植物中也有发现。 （4）异黄酮类和二氢异黄酮类

异黄酮类主要分布在被子植物中，豆科中占到70%左右，其余分布在桑科、鸢尾科中。

（5）花色素类

花色素类是使植物的花、果、叶、茎等呈现蓝、紫、红等颜色的化学成分，广泛

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地分布于被子植物中。

（6）黄烷类

黄烷-3-醇的衍生物称为儿茶素类，在植物中分布较广，主要存在于含鞣质的木本植物中。黄烷-3，4-二醇衍生物被称为无色花色素类，在植物界的分布也很广，其中在含鞣质的木本植物和蕨类植物中存在较多。该类化合物常因分子聚合而具有鞣质的性质。

（7）橙酮类

橙酮类定位与其它黄酮类化合物不同，在中药中比较少见，多存在于玄参科、菊科。

（8）双黄酮类

双黄酮类较集中地分布于除松科以外的裸子植物中，如银杏科、松科、杉科；蕨类植物中的卷柏属植物中也有分布。

（9）其他黄酮类

苯骈色原酮为一种特殊类型的黄酮类化合物，常存在于龙胆科、藤黄科植物中，在百合科植物中也有分布【15】。呋喃色原酮类和苯色原酮类在植物界中分布较少，如凯刺种子和果实中得到的凯林（khellin）属于呋喃色原酮类化合物。

1.4酶简介

酶水解法条件温和, 大豆异黄酮苷元不易变性, 目前已有研究报道。陈莲等采用β- 葡萄糖苷酶(β- glucosidase,Sigma- Aldrich Corporate), 水解脱脂黄芪片中的异黄酮, 从而增加了豆粕中染料木素含量。 1.4.1酶的基本介绍

酶（enzyme），早期是指in yeast 在酵母中的意思，指由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成（少数为RNA）。能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。 1.4.2酶的特性

（1）高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快。

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（2）专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽。

（4）多样性：酶的种类很多，大约有4000多种。

（5）温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的。 （6）活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。

（7）有些酶的催化性与辅因子有关。

（8）易变性：由于大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏。 （9）一般来说，动物体内的酶最适温度在35到40℃之间，植物体内的酶最适温度在40-50℃之间；细菌和真菌体内的酶最适温度差别较大，有的酶最适温度可高达70℃。动物体内的酶最适PH大多在6.5-8.0之间，但也有例外，如胃蛋白酶的最适PH为1.5，植物体内的酶最适PH大多在4.5-6.5之间。 1.4.3酶促反应

酶促反应（Enzyme catalysis）又称酶催化或酵素催化作用，指的是由酶作为催化剂进行催化的化学反应。生物体内的化学反应绝大多数属于酶促反应【16】。酶作为一种生物催化剂在催化一个化学反应时，即具有一般的催化剂的特征，又具有不同于一般催化剂的特殊性。酶与一般催化剂一样，只催化热力学允许的化学反应；可以加快化学反应的速度，而不改变反应的平衡点，既不改变反应的平衡常数；作用机理都是降低反应的活化能；在反应前后，酶没有质和量的改变，且微量的酶便可发挥巨大的催化作用。但是酶也具有不同于其他催化剂的特殊性。

在酶促反应中，酶作为高效催化剂，使得反应以极快的速度或在一般情况无法反应的条件下进行。酶是生物体内进行各种化学反应最重要的物质。影响酶催化速度有以下因素：温度、酸碱度、酶的浓度、被催化物质的浓度。

1.5纤维素酶简介

1.5.1纤维素酶基本介绍

纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。纤维素酶（英文：cellulase）是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中【15】。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一

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般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木酶属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium）。 1.5.2纤维素酶的组成与功能

纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或

图2.纤维素和几丁质分子结构图

endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen、外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase

或

exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex) 和β-葡聚糖苷酶（β-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区,产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端,释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。真菌纤维素酶产量高、活性大，在畜牧业和饲料工作中主要应用真菌来源的纤维素酶。

1.5.3纤维素酶降解纤维素的机理研究

纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。

1950年，Reese等提出了C1-Cx假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖。协同作用一般认为是内切葡聚糖酶(C1酶)首先进攻纤维素的非结晶区，形成Cx所需的新的游离末端，然后由CX酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由β-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖。不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，C1-Cx和β-葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。若先用C1酶作

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用结晶纤维素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此顺序作用却不能将结晶纤维素水解。

1.6大孔吸附树脂分离原理

大孔吸附树脂一般为白色球形颗粒状，粒度多为20~60目，通常分为非极性和中极性两类。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶媒。对有机物选择性较好，不受无机盐类及强离子低分子化台物存在的影响。大孔吸附树脂为吸附性和筛选性原理相结合的分离材料，与以往使用的离子交换树脂分离原理不同。它本身具有的吸附性，是由于范德华引力或产生氢键的结果【17】。筛性原理是由于其本身多孔性结构所决定。正因为有这些特性，使得有机化台物尤其是水溶性化合物的提纯得以大大简化。从显微形状上看，大孔吸附树脂包含有许多具有微观小球组成的网状孔穴结构，这些球体的构成， 多为苯乙烯型和2一甲基丙烯酸酯型， 前者非极性树脂， 后者为中极性树脂。大孔吸附树脂的“孔径”是指微观小球之间的平均距离(A )。其“比表两积”是指微观小球表面积的总和(Ell ／g) 由于吸附性和筛性原理， 有机化台物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而分开。大孔吸附树脂根据孔径、比表面积及构成类型被分为许多型号， 在应用中，可根据实际要求及化合物特性加以选择。国内外常用的一些不同型号大孔吸附树脂的型号及性能。

1.7抗氧化性的作用

生物的抗氧化能力与其抗病性、抗逆性及延缓衰老密切相关。因而从天然植物中寻找有效的抗氧化剂应用于医药、食品、保健品、饮料、化妆品等之中，或从氧化与抗氧化代谢的平衡来探讨生物对变化环境条件的适应性机理，都是当前研究的热点之一。适当补充外源抗氧化剂或给予能够促使机体内源性抗氧化物质恢复到一定水平的药物，可以改善衰老以及疾病的情况。抗氧化剂还是一种重要的食品添加剂\"它主要用于阻止或延缓油脂的自动氧化\"可以用于防止食品因氧化而使营养损坏、褐变、褪色等。抗氧化剂广泛应用于食品工业，需求量逐年增加，其中天然抗氧化剂的应用越来越广泛。

广义的抗氧化剂是指自由基及活性氧的清除剂、阻断剂及修复剂等物质的总称。通过测定植物提取物清除自由基的能力也能表明其抗氧化能力的强弱，研究自由基的检测方法并探讨物质对自由基的清除作用也有重要意义。迄今用于评价植物抗氧化能力的方法虽已有诸如硫氰酸盐法、硫代巴比妥酸法(ORAC)法等、但是这些方法或者所需试剂或大型仪器的费用昂贵,尚缺乏一种灵敏、简单易行的有效方法。

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第二章 实验

2.1实验材料与设备

2.1.1 材料

黄芪, 购自吉林长春中药材有限公司。纤维素酶( 酶活力为: 1.5 wU/g) , 购自江苏省无锡市雪梅酶制剂科技有限公司;染料木苷(genistin) 标准品和 ( 2,2- Diphenyl- 1- picrylhydrazyl) 购自美国密苏里州圣路易斯Sigma- Aldrich 公司; 甲醇为Fisher 色谱纯试剂, 购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆热电飞世尔科学有限公司; 二次蒸馏水为自制; 其他均为国产分析纯试剂。DPPH 自由基为自制，方法如下：0.0039432g三羟甲基氨定容于50ml无水乙醇中。 2.1.2设备

FA2004电子天平；FW110 型高速粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；UV - 2550 紫外分光光度计(日本岛津)；电子天平（北京赛多利斯仪器系统）；KQ—VDE型三频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；台式高速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；恒温循环水槽（北京长流科学仪器公司）；隔膜真空泵（天津市腾达过滤器件厂）；循环水空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；旋转蒸发仪(RE- 52A 型, 亚荣生化仪器厂, 上海)。

2.2实验方法

2.2.1工艺流程

原料→浸提→抽滤→浓缩→纯化→浓缩→DPPH测定→数据记录→绘图→总结 2.2.2实验过程 （1）粉碎

将片状黄芪根放入粉碎机中进行粉碎，然后将其装入小塑料袋中，用电子天平进行称量。

粉碎后黄芪的重量（g）+袋的重量（g）=47.73g 袋的重量（g）：1.0g

所以粉碎后黄芪的净重量为：46.73g

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（2）浸提

将70%的乙醇倒入锥形瓶中，并将粉碎好的黄芪倒入锥形瓶中，将清洗好的转子放入，用保鲜膜将瓶口盖住，放在磁力搅拌器上，搅拌一夜。 （3）抽滤

将搅拌好的浸提液用隔膜真空抽滤泵进行抽滤，将滤渣扔掉，将滤液用锥形瓶保存起来。 （4）浓缩

将滤液倒入圆底烧瓶中，在40℃的水温下用旋转蒸发仪进行浓缩。 （5）纯化

先将大孔吸附树脂用工业乙醇浸泡一夜，然后将乙醇放出，再用500ml的乙醇清洗一遍，然后用蒸馏水进行清洗，直至大孔吸附树脂中完全无乙醇的残留。将浓缩后的液体慢慢倒入大孔吸附树脂中，进行吸附，用500ml的蒸馏水进行清洗，再用500ml70%的乙醇进行解吸。 （6）浓缩

降解吸下来的液体分别倒入圆底烧瓶中，在50℃的水温下用旋转蒸发仪进行浓缩，然后将浓缩后的液体放入试管中，将试管放入冰箱中冷藏备用。

2.3黄芪提取物DPPH自由基的清除

2.3.1自由基的作用

自由基与人体一些重大疾病有一定的相关性, Harman提出的自由基学说认为: 自由基攻击生命大分子造成的损伤是引起机体衰老的根本原因, 也是诱发肿瘤等疾病的重大原因, 这一学说已被越来越多的人所接受。近年来, 对自由基及其清除剂的研究成为热点, 寻找、筛选具有阻断自由基形成或抑制细胞膜过氧化活性的药物研究越来越受到人们的关注, 其中对黄酮类化合物的研究是自由基清除剂研究中的热门领域之一, 到目前为止已发现的黄酮类化合物已超过5000多种。

自由基过量产生或人体自身清除自由基能力下降会导致多种疾病的产生与恶化。自由基对人体的损害主要有三个方面：一、使细胞膜被破坏；二、使血清抗蛋白酶失去活性；三、损伤基因导致细胞变异的出现和蓄积。自由基对人体的攻击首先是细胞膜开始的。细胞膜极富弹性和柔韧性，这是由它松散的化学结构决定的 ，正因为如此，它的电子很容易丢失，因此细胞膜极易遭受自由基的攻

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击。一旦被自由基夺走电子，细胞膜就会失去弹性并丧失一切功能，从而导致心血系统疾病。更为严重的是自由基对基因的攻击，可以使基因的分子结构被破坏，导致基因突变，从而引起整个生命发生系统性的混乱。大量资料已经证明，炎症，肿瘤、衰老、血液病、以及心、肝、肺、皮肤等各方面疑难疾病的发生机理与体内自由基产生过多或清除自由基能力下降有着密切的关系。炎症和药物中毒与自由基产生过多有关；克山病－－硒缺乏和范可尼贫血等疾病与清除自由基能力下降有关；而动脉粥样硬化和心肌缺血再灌注损伤与自由基产生过多和清除自由基能力下降两者都有关系。自由基是人类健康最隐避、最具攻击力的敌人。

自由基是指具有未配对价电子的原子、原子团或分子。大多数自由基化学性质极为活泼，寿命极短。然而也有少数的自由基的化学性质十分稳定\"即便在室温溶液中也很稳定。二苯代苦味肼基自由基就是其中的一个例子。它的稳定性主要来自共振稳定作用及三个苯环的空间障碍,而使夹在其中间氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用，由于DPPH给我们提供了一个试样与稳定自由基反应的信息,故可将此法用于自由基清除剂的筛选研究工作。DPPH分光测定法的测定原理是依据DPPH在517nm处有一强吸收，其乙醇溶液呈深紫色。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系。因而可用分光法进行定量分析。国外已有很多的学者用此法研究了物质清除自由基的性质。

2.3.2清除DPPH 自由基能力的测定原理

检测抗氧化剂清除自由基方法中以清除DPPH(1,1-diphenyl-2-PicrylhydRazyl)自由基最为常见。该方法的基本原理是DPPH 在溶液中生成一个稳定的含氮自由基且该溶液呈典型的紫色在紫外- 可见(UV-Vis)光区具有较强的吸收光谱。当DPPH 溶液中加入抗氧化剂时，由于其自由基清除作用使DPPH 紫色消退导致吸收光谱强度随加入的抗氧化剂的量的增加而减小，通过加入抗氧化剂前后吸光度的线性变化计算自由基清除率。通常抗坏血酸等具有递电子和递质子能力的抗氧化剂对DPPH 自由基的清除作用是通过抗氧化剂把电子和质子传递给DPPH 自由基，从而生成稳定的分子态的DPPH2 的结果，见下图。

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图3.抗氧化剂递电子、递质子与DPPH 自由基生成DPPH2 的反应式

DPPH 溶液在323nm 和517nm 波长处有两个特征的吸收峰。迄今，抗氧化剂对DPPH 自由基清除率是通过测定加入抗氧化剂前后DPPH 在517nm 波长处吸光度计算的。

2.3.3清除DPPH 自由基能力的测定方法

取130μL加酶)未加酶的原液用移液移至1.5ml的离心管内，用100 mmol/L pH7.4 的Tris- HCl 缓冲液稀释成1300μL，先分别取空白（0μL）、46μL、92μL、138μL、184μL、230μL、276μL、322μL至1.5ml的离心管内，然后分别加入460μL、414μL、368μL、322μL、280μL、230μL、184μL、138μL的100 mmol/L pH7.4 的Tris- HCl 缓冲液，最后在每组样品中分别加入540 μL DPPH 乙醇溶液，盖好每个离心管的的盖子，放在搅拌器上震荡，混合均匀，在暗处放置20 min。样品的抗氧化活性用DPPH 在517 nm 处的褪色来表示。

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第三章 结果与讨论

3.1数据记录与计算

表三、加酶试样的吸光度A及光度差

提取液体积/μL 0 46 92 138 184 230 276 加酶A 1.998 1.868 1.713 1.595 1.461 1.359 1.242 加酶A吸光度差 0 0.13 0.285 0.403 0.537 0.639 0.756 表四、未加酶试样的吸光度A及光度差

提取液体积/ul 0 46 92 138 184 230 276 322 未加酶吸光度A 1.998 1.884 1.766 1.624 1.539 1.458 1.358 1.274 未加酶吸光度差 0 0.114 0.232 0.374 0.459 0.54 0. 0.724 3.2DPPH 自由基清除率的计算

黄酮类化合物(Flavonoids)是多酚类物质，是许多中草药的有效成分。黄酮化合物由于结构上的特点，是一类天然的抗氧化活性的物质，对超氧阴离子自由基(O-2·)、羟自由基(·OH)和单线态氧(1O2)有良好的清除作用。羟自由基(·OH)

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非常活泼，在含氧自由基中其氧化活性最强。该产物在517 nm处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除羟自由基功能的被测物，便会与水杨酸竞争羟自由基，从而使有色产物生成量减少。在517nm处测量含被测物反应液的吸光度,并与空白液比较,便能测定被测物对OH·的清除作用。其清除率计算式为： 自由基清除率( %) =（A0-Ai）/ A0*100

表五、加酶试样的清除率

提取液体积/μL 0 46 92 138 184 230 276 322 体积比 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 加酶试样的清除率( %) 0 6.506507 14.226 20.17017 26.87688 31.98198 37.83784 41.09109 加酶样清除率曲线45403530清除率% 252015105000.10.20.30.4体积比0.50.60.70.8加酶样清除率共 29 页 第 23 页 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 装 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 订 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 线 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊

表六、未加酶试样的清除率

提取液体积/μL 体积比 0 46 92 138 184 230 276 322 清除率%未加酶试样的清除率( %) 0 5.705706 11.61161 18.71872 22.97297 27.02703 32.03203 36.23624 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 未加酶样清除率曲线403530252015105000.10.20.30.40.5体积比0.60.70.8未加酶样清除率

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表七、试样清除率汇总

提取液体积/μL 0 46 92 138 184 230 276 322 45黄芪提取物清除DPPH能力曲线体积比 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 加酶试样的清除率( %) 0 6.506507 14.226 20.17017 26.87688 31.98198 37.83784 41.09109 未加酶试样的清除率( %) 0 5.705706 11.61161 18.71872 22.97297 27.02703 32.03203 36.23624

清除率%403530252015105000.10.20.30.40.5体积比0.60.70.8加酶样清除率未加酶样清除率共 29 页 第 25 页

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3.3实验讨论

DPPH 是一种含有奇数个电子的稳定自由基, 其乙醇溶液呈深紫色, 在波长517 nm 下有最大吸收值。当被具有抗氧化能力的试剂( 强还原剂) 还原时, 两分子DPPH 上的奇数电子会与抗氧化物质结合, 形成一分子的DPPH 与抗氧化物质结合的复合分子和一分子DPPH 还原态分子, 此时在波长517 nm 下的吸收值就会降低。因此, 测定样品对DPPH 的清除能力, 可以比较抗氧化活性。

在本研究中, 测定了纤维素酶水解前后黄芪提取物的浓度与清除率的关系。如下图结果表明:随着浓度的增加, 两种异黄酮样品对DPPH 自由基的清除率都随之增加; 在相同浓度下, 酶解后的黄芪提取物自由基的力要明显高于酶解前的异黄酮糖苷混合物;酶解后增加的异黄酮苷元比酶解前相应的异黄酮糖苷具有较高的抗氧化活性。本次研究未给出大于50 %清除率的实验结果, 主要是因为高浓度的黄芪粗提取物对比色体系具有较强的干扰作用。黄芪苷和染料木苷葡萄糖残基所形成的β- 1,7 糖苷键, 生成黄芪素和染料木素, 从而提高异黄酮的抗氧化活性; 纤维素酶不能水解丙二酰基染料木苷和丙二酰基黄芪苷分子中被丙二酰基所修饰的葡萄糖残基还原端所形成的β- 1,7 糖苷键, 表现出基团专一性。

3.4实验结果

（1）黄芪提取物具有抗氧化性

（2）黄芪提取物经纤维素酶处理后，提高了抗氧化话性。

（3）黄芪提取物异黄酮中苷元被纤维素酶水解转化为苷元是槐角异黄酮抗氧化性提高的原因之一

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第四章 结论

随着浓度的增加, 两种黄芪提取物对DPPH 自由基的清除率都随之增加，在相同浓度下, 酶解后的黄芪提取物清除自由基的能力要明显高于酶解前的黄芪提取物;酶解后增加的异黄酮苷元比酶解前相应的异黄酮糖苷具有较高的抗氧化活性。

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致谢

感谢食品科学与工程专业的老师，在我大学期间对我学习和工作上的帮助。老师们认真负责的工作态度，严谨的治学精神对我以后的工作和学习都有巨大的帮助。还要特别感谢老师在我学习及论文完成过程中给予的无私奉献和真诚帮助，老师们深厚的理论水平使我少走很多弯路，也使我学会了很多科研方法，对我以后的学习和生活都有很大的影响。感谢我亲爱的同学们对我的帮助!最后，要感谢我的家人，他们对我的支持是我不断前进的动力!

再一次向所有关心和帮助过我的人们表示深深的感谢! 谢谢!

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