大鼠骨骼肌卫星细胞培养的研究

大鼠骨骼肌卫星细胞培养的研究

张晨晖,朱道立

＊

　(南通大学生命科学学院,江苏南通226007)

摘要　[目的]探讨在体外条件下骨骼肌卫星细胞纯化、培养、鉴定的方法及确定其生物学特性。[方法]取新生大鼠的小腿肌肉,采用肌组织块和肌细胞培养两种方法。分别用胰蛋白酶对培养中的肌组织块和肌细胞进行消化,采用离心及差速贴壁法纯化,得到更高纯度的大鼠骨骼肌肌卫星细胞,进行体外原代骨骼肌和传代骨骼肌的细胞培养。传至第2代后,用分化培养基诱导分化,观察骨骼肌细胞各个阶段的形态特征并拍照。[结果]此方法分离的细胞成活率较高,体外生长、增殖良好。在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。[结论]该实验成功探讨了新生大鼠骨骼肌卫星细胞的分化能力并建立了卫星细胞纯化方法,适用于开展细胞移植和肌组织工程方面的研究。关键词　大鼠;骨骼肌;原代培养;传代培养;纯化

+

中图分类号　S865.12　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)12-05004-03StudyonCultureoftheSkeletalMuscleSatelliteCellsintheNeonateRatsZHANGChen-huietal　(SchoolofLifeScience,NantongUniversity,Nantong,Jiangsu226007)Abstract　[Obective]Themethodsofthepurification,cultureandidentificationandthebiologicalcharacteristicsofskeletalmusclesatellitecellsinvitrowereexplore.[Methods]Skeletalmusclespecimensharvestedfromratswereusedtodopuretissuecultureandmusclecellculture.Theskeletalmusclesatellitecellswereseparatedwithtrypsin.Theskeletalmusclesatellitecellswereobtainedbycentrifugeandvelocitysedimentation,thenthecellswerecul-turedandsub-culturedinvitro.Thesecondlycellswereup-growninthedifferentiationmedia.Morphologicalobservationwasusedandphotosweretakeninallstages.[Result]Thecellsisolatedbythismethodshowedstrongproliferateabilityintheproliferatemediainvitroandcouldformmyotubesindifferen-tiationmedia.[Conclusion]Inall,amethodforexploringthedifferentiationabilityandthepurificationtechniqueofsatellitecellwasestablishedsuccess-fully,whichwasusefulforcelltransplantingormuscletissueengineering.Keywords　Rat;Skeletalmuscle;Primaryculture;Secondaryculture;Purification

　　骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中位于细胞膜和肌膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性干细胞,负责骨骼肌的生长和损伤修复[1-3]。近年来,国外有报道将肌卫星细胞移植到冻伤的骨骼肌中,可改善肌肉功能[4]。另外,骨骼肌可能会通过分泌低分子量细胞因子即骨骼肌源性抑瘤物显著抑制肿瘤细胞生长[5-8]。笔者旨在探讨体外培养的大鼠骨骼肌卫星细胞的分离纯化、原代与传代的培养方法,在细胞的培养过程中改变培养条件对其生长与分化的影响;以及随时间的推移,骨骼肌细胞的生长与分化特征,为将来进行骨骼肌干细胞临床应用,治疗心肌梗死及防治肿瘤奠定基础。1　材料与方法

1.1　材料　出生后1d的SD大鼠(Rattusnorvegicussprague-dawley)(南通大学实验动物中心提供),雌雄不限。

试剂:胰蛋白酶(Trypsin)、L-多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)均购自Sigma公司;DMEM/F12培养基、小牛血清(Fetalbovineserum)购于北京清大天一生物技术有限公司。

生长培养基:含10%新生小牛血清的DMEM/F12培养基;分化培养基:含2%新生小牛血清的DMEM/F12培养基。1.2　培养瓶包被　吸取适量0.001%的L-多聚赖氨酸溶液加入25cm2的无菌培养瓶内,然后放入37℃、5%CO2培养箱中培养24h以上。使用前将培养瓶取出,倒去其中的液体,并用生长培养基冲洗后备用。整个包被过程均需在无菌条件下进行[9]。

1.3　骨骼肌卫星细胞的获取与培养1.3.1　取材。将新生大鼠拉颈椎处死,再用碘酒和乙醇消毒腿部,将新生鼠放入超净工作台后,取腿部肌肉置于平皿

基金项目　南通大学第3批大学生课外学术科技作品立项课题(加

13)。

作者简介　张晨晖(1988-),女,浙江温州人,本科生,专业:医学生物

技术。＊通讯作者,教授。

收稿日期　2008-02-25中。用Hank's液洗涤3次,并剔除脂肪、结缔组织、血液等杂

3

物。用手术剪将肌肉剪成小块(1mm),转移至离心管中,再用Hank's液洗3次,静置1min后弃去上层液体及漂浮组织。1.3.2　组织块培养法。将剪碎的肌肉碎片转移到培养瓶(经L-多聚赖氨酸包被的培养瓶与未包被的各半,以形成对照组)内,贴附于瓶底面。翻转瓶底朝上,将培养液加至瓶中,培养液勿接触组织块。放入37℃、5%CO2培养箱静置3～5h,轻轻翻转培养瓶,使组织块浸入培养瓶中(勿使组织块漂浮),继续培养。3d后换液,以后每天换液1次。1.3.3　细胞培养法。向上述离心管中加入0.25%的胰蛋白酶,置于37℃水浴锅中消化20min,每隔5min摇动1次离心管,或用吸管吹打1次,使细胞分离。然后加入生长培养基终止消化。反复吹打后,依次滤过100、200、400目的筛网,滤液收集后,1000r/min离心10min,弃上清,用生长培养基重新悬浮细胞,将细胞悬液加入未经L-多聚赖氨酸包被的培养瓶中,采用差速贴壁法去除成纤维细胞,37℃培养1h后移至经L-多聚赖氨酸包被的培养瓶内用生长培养基进行培养,4d后换液,以后每天换液1次。倒置显微镜下观察细胞的生长情况。1.4　细胞的传代培养　待培养瓶内的细胞达到一定密度后,将培养瓶中原来的培养液弃去,用0.25%胰酶溶液消化10～30s,加入生长培养基终止消化,用吸管反复吹打瓶壁上的细胞,使其完全脱落,以1∶1的比例传代,每天换液1次。倒置显微镜下观察细胞的生长情况。1.5　分化培养基诱导分化　取培养至第2代的细胞,消化后加入生长培养基进行培养,待细胞、增殖至80%汇合后,改用分化培养基(含2%小牛血清的培养基)继续培养,倒置显微镜下观察细胞生长及分化情况[10-11]。

1.6　骨骼肌卫星细胞的鉴定　将细胞培养液内小牛血清浓度降至2%,3～4d后细胞相互融合成肌管,肌管为光滑长条形。虽然卫星细胞的形态与成纤维细胞极为相似,但在镜下36卷12期　　　　　　　　　　　　　　　　张晨晖等　大鼠骨骼肌卫星细胞培养的研究5005

仍显示出有较大的差别。成纤维细胞的形态呈扁平、多突起的,而卫星细胞早期则以梭形、纺锤形为主,相互之间以细丝拉网,随培养时间的延长,细胞增殖、相互融合并逐渐规律性

地沿一个方向平行排列,并形成多核的肌管。传代后2h就开始贴壁。

注:A.培养2d的新生大鼠骨骼肌组织块,已有大量细胞游离出来(箭头所指为组织块)(×100);B.培养6d的新生大鼠骨骼肌卫星细胞,规律

性地沿一个方向平行排列(×100);C.培养7d的新生大鼠骨骼肌卫星细胞,形成肌管(×250);D.培养8d的新生大鼠骨骼肌卫星细胞呈梭形、纺锤形(×100);E.培养9d的新生大鼠骨骼肌卫星细胞,细胞相互融合,形成肌管(×100);F.成纤维细胞呈扁平、多突起(×100)。　Note:A.theskeletalmusclefromneonatalratculturedfor2days,alotofcellsdissociated(arrowheadshowingtissuemass)(×100);B.theskeletalmuscle

satellitecellsfromneonatalratculturedfor6days,parallelalignmentregularly(×100);C.theskeletalmusclesatellitecellsfromneonatalratculturedfor7days,myotubeformed(×250);D.theskeletalmusclesatellitecellsfromneonatalratculturedfor8days,assumedspindleandfusiform;E.theskeletalmusclesatellitecellsfromneonatalratculturedfor9days,cellfusedandmyotubeformed(×100);F.fibroblastassumedflatandmoreprotuber-ance.

图1　新生大鼠骨骼肌卫星细胞原代与传代培养

Fig.1Theprimarycultureandsubcultureofskeletalmusclesatellitecellsofneonatalrat

注:A.新生大鼠骨骼肌组织块培养第1次传代培养1d的细胞(×100);B.新生大鼠骨骼肌组织块第1次传代培养3d的细胞,细胞排列出现方

向性(×100);C.新生大鼠骨骼肌组织块第1次传代培养4d的细胞,细胞沿一个方向平行排列(×100);D.新生大鼠骨骼肌组织块培养第2次传代后培养1d的细胞(×100);E.新生大鼠骨骼肌细胞培养第2次传代后培养1d的细胞(×100);F.新生大鼠骨骼肌组织块培养第2次传代中加入分化培养基培养2d的细胞,正在融合成肌管(×250);G.新生大鼠骨骼肌细胞培养第2次传代中加入分化培养基培养2d的细胞,也正在融合成肌管(×250);H.新生大鼠骨骼肌组织块培养第2次传代中加入分化培养基培养3d的细胞,继续融合形成肌管(×250)。　Note:A.theskeletalmuscletissuemassfromneonatalratculturedfor1day(×100);B.theskeletalmuscletissuemassfromneonatalratculturedfor3

days,directivityappeared(×100);C.theskeletalmuscletissuemassfromneonatalratculturedfor4days,parallelalignmentregularly(×100);D.theskeletalmuscletissuemassfromneonatalratsubculturedfor1day(×100);E.theskeletalmusclecellsfromneonatalratsubculturedfor1day(×100);F.theskeletalmuscletissuemassfromneonatalratsubculturedondifferentiationmediumfor2days,formingmyotube(×250);G.theskeletalmusclecellsfromneonatalratsubculturedondifferentiationmediumfor2days,formingmyotube(×250);H.theskeletalmuscletissuemassfromneonatalratsubculturedondifferentiationmediumfor2days,continuingfusionandformingmyotube(×250).

图2　新生大鼠骨骼肌卫星细胞原代与传代培养

Fig.2　Theprimarycultureandsubcultureofskeletalmusclesatellitecellsofneonatalrat

5006　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年

2　结果与分析

2.1　骨骼肌卫星细胞的形态　倒置显微镜下观察到分离纯化的大鼠骨骼肌卫星细胞为圆形,折光性强,24h后开始贴壁,96h后完全贴壁,细胞呈梭形或纺锤形,中间夹杂少量未过滤掉的纤维碎片,细胞生长缓慢。随细胞密度的增加,细胞逐渐有规律地平行排列(图1-B)。当细胞融合到一定程度之后,不需要加分化培养基也可自发性地相互融合,形成肌管(图1-E)。待细胞密度达到70%～80%时,进行传代培养,发现室温下20s消化结果最佳,1∶1接种于培养瓶中,传代细胞30min后开始贴壁,24h内贴壁完全(图2-A),增殖速度也比原代快。传至第2代的细胞培养2d,待其完全贴壁后,采用分化培养基诱导分化。2.2　骨骼肌卫星细胞的分化　当大鼠骨骼肌卫星细胞传至第2代时,将细胞培养液中小牛血清的浓度降至2%,骨骼肌卫星细胞在分化培养基的作用下,3～4d内细胞相互融合成肌管(图2-H),肌管为光滑长条形。许多细胞核聚集在一起,位于肌管的,肌管之间多呈平行排列(图2-G)。3　讨论3.1　骨骼肌卫星细胞的分离与纯化　胰蛋白酶消化时间的把握,是该实验取材的关键。因新生大鼠肌肉组织比较脆弱,且胰蛋白酶消化时间过长会损伤卫星细胞,因此要达到卫星细胞的最大产出率而且不损伤卫星细胞的贴壁能力,必须控制好胰蛋白酶消化时间[12]。实验采用胰蛋白酶消化法而不使用胶原酶+胰蛋白酶消化法将肌肉组织松懈,因为胶原酶+胰蛋白酶消化法一般是应用于成熟的成年大鼠骨骼肌组织,将骨骼肌卫星细胞从基膜中释放出来。根据经验,发现胰蛋白酶的消化时间控制在20s左右较好。通过换液去除不贴壁的细胞(如淋巴细胞等),差速贴壁法去除成纤维细胞和结缔组织,从而达到纯化骨骼肌卫星细胞的目的[13-14]。

3.2　骨骼肌卫星细胞的分化与鉴定　骨骼肌卫星细胞的正常分化过程为:首先分化为成肌细胞;随后成肌细胞逐渐平行排列,相互融合在一起,形成细胞核在、肌丝在周边的肌管;随着分化过程的深入,肌丝不断生长并形成肌原纤维,细胞核则逐渐靠向周边,从而形成肌纤维。体外培养条件下,可以通过降低培养基中动物血清的含量来实现。一般学者采用1%～5%的胎牛血清加入马血清作为分化培养基[15-16],该实验尝试采用2%小牛血清作为分化培养基,在未加入马血清的条件下诱导骨骼肌卫星细胞分化。骨骼肌卫星细胞在分化培养基作用下,细胞间发生融合,形成肌管的能力显著增强。显而易见,肌管形成是骨骼肌卫星细胞分化的典型标志。

3.3　体外培养骨骼肌卫星细胞的发展趋势　骨骼肌卫星细胞是组织特异性的成肌前体细胞或单能成肌干细胞,具有增殖和自我更新能力,在出生后骨骼肌的损伤、修复和维持中起着重要的作用[17-18]。一般情况下,骨骼肌卫星细胞是位于肌膜和基底膜之间具有增殖分化潜能的肌源性干细胞,平时保持不、静止状态[19]。但是,当肌细胞受到损伤刺激时,卫星细胞即被激活、增生并表达成肌细胞标记物。最终,这些细胞同原有的骨骼肌细胞相互融合,形成新的肌纤维细

胞,恢复骨骼肌的连续性及功能。所以,在细胞移植的研究中,骨骼肌卫星细胞移植有广泛的临床应用前景。国外有报道骨骼肌卫星细胞具有造血重建的潜能[20];心肌梗死动物模型的实验研究表明,干细胞移植改善了梗死心肌的功能,但其作用机制尚不十分清楚。骨骼肌卫星细胞移植还可用于治疗肌营养不良性萎缩,在心肌梗死、压力性尿失禁、输尿

[21-22]

管反流等疾病的治疗中也有疗效,因此备受广大学者的青睐。文献报道[23],肌细胞可通过分泌低分子量细胞因子即骨骼肌源性抑瘤物,如肿瘤坏死因子、淋巴细胞浸润因子、干扰素或转化生长因子等显著抑制肿瘤细胞生长。然而,以上所涉及的种种研究都离不开卫星细胞的分离和培养环节。如何在保持高纯度的前提下提高卫星细胞的产率,大量、快速地在体外使卫星细胞增殖,以及如何进一步改进无血清培养基都有待于深入探讨。参考文献

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