实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质
系别：机械工程系 班级：机械11实验者：潘霖 学号：20110103
同组姓名：肖鹤翀 实验日期：2011.10.22
Ⅰ 提取与分离
一、 实验目的：
1. 学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2. 了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。
二、 实验原理:
叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶
黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。
薄层层析色谱法是将吸附剂均匀地涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。
植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适用于大量制备。本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。
三、 实验材料与试剂:
1. 新鲜的菠菜叶片。
2. 体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1，体积比）。 3. 研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸。
四、 实验步骤:
（一） 色素提取液的制备
1. 取新鲜叶片4~5片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎，放入研钵中。 2. 向研钵中加入少量CaCO3粉末，再加2~3ml体积分数为95%的乙醇，充分研
磨至糊状，再加10~15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤出，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。提取液应避光保存，因提取量较大，可用于其他相关实验（如后面的叶绿素理化性质的验证）。
（二） 叶绿体色素的分离
1. 取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，
距下边缘1cm处用毛细管划线，保证划线细直。自然风干后划第二次，重复操作3~4次，确保划的滤液细线颜色足够深，从而保证分离结果更加明显。
2. 取已经加入适量展开剂的层析缸，把硅胶预制板划过滤液细线的一端放
入，使其下端浸入展开剂中，但注意展开剂液面不可没过滤液细线。迅速改好层析缸盖（减少展开剂中的苯的挥发）。注意观察硅胶预制板上的颜
色变化，不久即可看到各种色素的色带。
3. 当各种色素得到较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板上端边缘处时，取
出硅胶预制板迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。 4. 测量并记录前沿和各个色素带距离原点的距离。
五、 实验结果与分析:
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色素带自上而下分别为：胡萝卜素，叶绿素a，叶绿素b，叶黄素。
经过薄层色谱分离后，叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。 衡量各色素带在薄层中的位置的相对比移值Rf= （斑点中心到原点的距离）/（溶剂前沿至原点的距离） 各自到原点的距离： 展开剂前沿：8.50cm 胡萝卜素：8.10cm ，Rf=0.9 叶绿素a：6.70cm ，Rf=0.79 叶绿素b：6.30cm ，Rf=0.74 叶黄素：5.90cm ，Rf=0.69
事实上硅胶预制板上不止出现了四种色素带，但与实验无关，故忽略。
Ⅱ 叶绿体色素理化性质的检验
一、 实验目的：
验证叶绿体素的理化性质。
二、 实验原理：
1. 叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成
甲醇和叶绿素醇及叶绿素盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
2. 叶绿素吸收光子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回基态时
可发射出红光量子，因而产生荧光。
3. 叶绿素的化学性质很不稳定，易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，
破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
4. 叶绿素中的镁可以被H+取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜成为铜代叶
绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
三、 实验材料与试剂：
1. 新鲜菠菜叶片，叶绿素提取与分离实验中制得的叶绿体色素乙醇提取液。
2. 10ml移液管，小试管，试管架，水浴锅（60℃和90℃各一个），洗耳球。
3. 体积分数为95%的乙醇，苯，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸-醋酸铜
溶液，氢氧化钾-甲醇溶液。
四、 实验步骤：
（一） 验证光对叶绿素的破坏作用
1.取2支小试管，各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用体积分数为95%的乙醇稀释一倍。将其中一支放在直射阳光下，另一只用锡纸包严置于试管架上，40min后对比观察颜色有何变化。
（二） 皂化作用（绿色素与黄色素的分离）
1． 取1支小试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，加入1ml氢氧化钾-甲醇溶液，充分摇匀。
2． 片刻后，加入3ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1ml左右蒸馏水，轻轻
混匀（勿激烈摇荡），然后置于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。
（三） H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用
1． 取两支试管，第一支加叶绿体色素提取液5ml，作为对照。第二支试管加
叶绿体色素提取液5ml后，再加入质量分数为5%的稀盐酸数滴，摇匀，观察溶液颜色变化情况。当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，60℃水浴加热，观察溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。
2． 取剪碎的新鲜菠菜叶片几片，放入试管中，加醋酸-醋酸铜溶液，使之没过
叶片，90℃水浴加热，随时观察叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。
（四） 荧光现象的观察实验
取一支小试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在照射灯的直射光下照射，观察并比较溶液的透射光与反射光的颜色。
五、 实验结果与分析：
（一） 光对叶绿素的破坏作用
实验前（左边试管进行光照处理） 实验后（实验过程中右边用锡箔纸包严的试管不慎打翻。） 用另外一支试管取置于暗处的叶绿体色素溶液进行对比，右边为光照后的叶绿体色素溶液
由于实验操作失误，只对有效的第三幅图描述：光照处理过的叶绿体色素溶液相
对置于暗处的叶绿体色素溶液明显颜色更浅。原因：叶绿素在光照的作用下被破坏了部分，使得经直射光处理过的试管中提取液的颜色看上去变浅了。 （二） 皂化作用（绿色素与黄色素的分离）
试管中溶液出现明显的分层现象，上层显黄色，下层显绿色，底部有明显的乳白色沉淀。 原因：上层是苯溶液，溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素，下层是稀的乙醇溶液溶有皂化的叶绿素a和叶绿素b及少量的叶黄素。底部的乳白色沉淀是叶绿体色素提取液中某些成分与碱发生了化学反应的产物。
（三） H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用
绿色 → 黄色 → 绿色 （四） 荧光现象的观察
在直射光的照射下，叶绿体色素提取液的反射光呈红色 在直射光的照射下，叶绿体色素提取液的透射光呈绿色
